基因編輯技術CRISPR的發展簡史：從發現到爆炸
北京時間12月19日，《自然》公佈了年度10大人物，Broad研究所David Liu開發出了一款全新的“堿基編輯器”而當選，2013年張鋒同樣因為CRISPR基因編輯技術的開發而入選。由此可見CRISPR基因編輯技術備受外界關注。
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►DAVID LIU當選《自然》2017年十大人物之一，圖片來自Nature
三十年前，實驗生物學家在分析寄居於人類腸道的細菌的一個基因時，偶然發現一組重複回文密碼。之後這類密碼在其他細菌基因組陸續被發現。
作為當今生命科學領域最火熱的基因編輯技術，CRISPR因其高效、便捷、適用範圍廣，為科研工作者帶來了福音，同時其廣泛應用也促進了基礎科研、農業、基礎醫學及臨床治療的發展。
1987年，Nakata研究組在分析大腸桿菌（Escherichia coli）中基因iap及臨近序列（flanking regions）時，偶然地發現在位於iap的3’端存在含有29個堿基的高度同源序列重複性出現，且這些重複序列被含32個堿基的序列間隔開，當時科學家並不清楚這種序列的生物學意義。隨後的幾年（1989年-1999年），陸續有相關研究指出類似的重複序列存在於多種細菌及古生菌中。
CRISPR一詞正式登上歷史舞臺還是2002年的事。Jansen實驗室通過生物資訊學分析，發現這種新型DNA序列家族只存在于細菌及古生菌中，而在真核生物及病毒中沒有被發現，並將這種序列稱為規律間隔成簇短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)。
CRISPR能在細菌的免疫功能中起作用在2007首次得到實驗證實。Horvath研究組發現嗜熱鏈球菌被病毒入侵後整合了來自噬菌體基因組新的間隔區序列，同樣的病毒再次入侵時細菌就有了抗性，使其免遭攻擊。同時人為地去除或添加特定的間隔區序列，會影響細菌的抗性表型。因此，他們認為CRISPR及cas基因一起為嗜熱鏈球菌提供了對噬菌體的抗性作用，同時抗性的特異性取決於CRISPR中的間隔區序列，細菌的這種免疫性是可以遺傳的。至此，雖然科學家並不清楚CRISPR/Cas抵抗病毒的具體機制，但他們開始逐漸揭開其神秘的面紗。
2008年，Oost實驗室揭示了宿主細胞中CRISPR的間隔序列如何在cas蛋白的協助下介導發揮抗病毒作用。他們發現在CRISPR轉錄後，cas蛋白會形成一個稱為Cascade的複合物，裂解每個重複單元中的CRISPR RNA前體（pre-crRNA），但裂解產物都保留了間隔序列。在解旋酶cas3的作用下，成熟的CRISPR RNA(crRNA)發揮小嚮導RNA（small guide RNA）的角色，促使Cascade干預病毒的增殖。2009年，Mojica團隊指出前間隔序列臨近的PAM序列為原核生物中CRISPR/Cas發揮免疫識別提供了靶標。
2011年，Charpentier研究組通過對人類病原體化膿性鏈球菌的差異化RNA測序，揭示了反式編碼crRNA（tracrRNA）參與pre-crRNA的加工成熟過程。他們指出，tracrRNA通過24個核苷酸與pre-crRNA中的重複序列互補配對，在保守的內源性RNA酶III和CRISPR相關的Csn1蛋白的參與下指導pre-cr RNA的成熟過程，這些組分對保護化膿性鏈球菌免受噬菌體DNA的入侵必不可少，研究揭示了crRNA成熟的新途徑。
以上我們一直在介紹CRISPR/Cas的發現及細菌、古細菌如何利用該系統來沉默外來核酸以抵禦病毒及質粒的入侵。CRISPR/Cas作為基因編輯系統被應用最早開始於2012年兩位女神的強強聯合，她們分別是來自加州大學伯克利分校的結構生物學家詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）和瑞典于默真大學的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）。她們通過體外實驗證明：成熟的crRNA通過堿基互補配對與tracrRNA形成特殊的雙鏈RNA結構，指導cas9蛋白在目標DNA上引起雙鏈斷裂。在與crRNA指導序列互補的位點，cas9蛋白的HNH核酸酶結構域切割crRNA的互補鏈，而cas9蛋白RuvC樣結構域切割非互補鏈。當雙tracrRNA：crRNA被嵌合到一條RNA時，同樣可以指導cas9切割雙鏈DNA。她們的研究證明，在雙鏈RNA指導下切割雙鏈DNA斷裂的內切酶家族並揭示了CRISPR/Cas系統在RNA指導下進行基因編輯的巨大潛力。
►CRISPR/Cas系統發現歷程中的主要貢獻者
之後就一發不可收拾，緊接著是2013年初的兩篇Science和一篇Cell文章，它們分別由來自于哈佛大學醫學院的George Church、麻省理工學院博多研究所的張鋒以及加州大學三藩市分校系統及合成生物學中心的Lei S. Qi（目前就職於斯坦福大學）實驗室，這三篇文章都將CRISPR/Cas系統成功應用到哺乳動物細胞中。其中Church研究組設計了II型CRISPR/Cas系統，在人類細胞中設計特定的gRNA。對於內源性AAVS1基因座，他們成功獲得了293T細胞中10％至25％，K562細胞中13％至8％以及誘導多能幹細胞中2％至4％的靶向率。他們同時表明這個過程依賴於CRISPR元件，是特定的序列；在同時引入多個gRNA時，可以實現對目標基因座的多重編輯。張鋒實驗室證實了cas9可以在小RNA的指導下在人類及小鼠細胞中對內源基因座實現精確切割，同時他們將cas9改造為缺口酶促進同源修復。Qi與同事則將II型CRISPR/Cas系統中的cas9蛋白改造成失去核酸內切酶活性的dCas9，將其與gRNA共表達，產生一種DNA識別複合物使其特異性地干擾轉錄延伸，RNA聚合酶或轉錄因數與DNA的結合達到抑制目標基因表達的目的。他們將其稱為CRISPRi，實現了對大腸桿菌中基因的有效抑制，且沒有明顯的脫靶效應。而且可以實現同時抑制多個基因，他們表明CRISPRi也適用於哺乳動物細胞。很快人們利用CRISPR/Cas系統實現了對斑馬魚、真菌及細菌的基因編輯。2013年5月，Jaenisch研究組利用CRISPR/Cas介導的基因工程技術製造了在多個基因上含有多重突變的小鼠，極大地促進了體內多基因的功能學研究。隨後，人們實現了對果蠅、線蟲、大鼠、豬、羊、以及水稻、小麥、高粱等多種生物的基因編輯。
►基因編輯技術的基本原理，圖片來自origene.com
距開始利用CRISPR/Cas進行基因編輯不到一年時間裡，人們就實現了用該系統來校正遺傳疾病。2013年12月，李勁松研究組和Hans Clevers研究組利用CRISPR/Cas9系統分別校正了小鼠白內障及人幹細胞中一種與囊腫性纖維化相關聯的基因缺陷。同時，研究者通過向人類細胞轉染慢病毒包裝的sgRNA庫，實現了對基因組範圍的功能性篩選。2015年4月，黃軍就和團隊首次修飾人類胚胎DNA，為治療一種在中國南方兒童中常見的遺傳病——地中海貧血症提供了可能。
隨著對CRISPR系統研究的不斷深入，也暴露了一定的缺陷和局限性，如嚴重的脫靶效應。2015年9月，張鋒研究組報導了一種不同於Cas9的新型2類CRISPR效應因數Cpf1。他們的研究證明，Cpf1是一種不依賴tracrRNA，由單個RNA介導的核酸內切酶。Cas9是在同一個位置同時剪切DNA分子的雙鏈，形成的是平末端；而Cpf1剪切後形成是兩個不同長度的鏈，被稱之為黏性末端。同時Cpf1能夠識別富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列，可以擴展CRISPR的編輯範圍。
已知的許多遺傳疾病由點突變引起，然而目前糾正點突變的方法存在效率低或引起隨機缺失或插入等缺陷。2016年4月，David R. Liu研究組報導了一種堿基編輯的新方法。他們將胞嘧啶脫氨酶與CRISPR/Cas9進行融合，在gRNA的指導下，不引起DNA雙鏈斷裂，直接實現胞嘧啶（C）到尿嘧啶（U）的轉變，而DNA複製進一步使得U被T代替，從而實現C→T (or G→A)的轉換。這種堿基編輯器可有效糾正多種與人類疾病相關的點突變。他們還發展了第二、第三代堿基編輯技術，進一步提高堿基編輯效率。在此基礎上，上海科技大學陳佳研究組與合作者共同開發了一種增強型堿基編輯器。他們發現，將含有尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(UGI)的質粒與sgRNA/BE3共同轉染293FT細胞，經深度測序分析，與單獨轉染sgRNA/BE3相比，共轉染的方法減低了錯配頻率並提高了C-到T-的替換效率。他們還發現UGI的表達水準與C-到T-的堿基替換效率成正相關。為了提高實驗的方便性，研究者還將多個重複UGI與BE共表達在同一載體，與靶向不同基因座的多個sgRNA共同轉染293FT細胞，結果表明這種增強型堿基編輯器大大提高了編輯效率。
2016年6月，張鋒研究組發現一種來自纖毛菌（Leptotrichia shahii）的效應因數C2c2（現被稱為cas13a），具有RNA介導的RNA酶功能。體外生化分析顯示C2c2可在單個crRNA指導下剪切靶向單鏈RNA。細菌內，C2c2可被用來敲低特異性的mRNA，RNA酶活性依賴於HEPN結構域，C2c2是第一個被發現的靶向RNA的CRISPR效應因數。
2016年10月，第一個由CRISPR/Cas9編輯進行的臨床治療實驗由Lu團隊完成，研究者分離患有轉移性非小細胞肺癌病人血液中的免疫細胞，特異性的敲除PD-1基因，對細胞擴增培養後輸回患者體內以期抵抗癌症。
2017年10月，David R. Liu團隊將編碼tRNA腺嘌呤脫氨酶(TadA)的基因引入大腸桿菌內，經歷了漫長的7代篩選後，開發出了一款全新的“堿基編輯器”，將進化後的TadA與CRISPR/Cas9系統融合，在不引起DNA鏈斷裂的情況下實現了A•T到G•C的轉換，且在人體細胞中，編輯效率超過了50%。這樣就實現了C•G 到 T•A和A•T 到G•C的高效編輯，為多種遺傳疾病的治療提供了有效工具。
重大里程碑：美“魔剪”抗癌首例人體實驗將在賓大進行！當年的太空競賽正在 CRISPR 應用上重演，中美醫療競爭號角已吹響
數十年來，人類從未停止過與癌症的抗爭，血、淚、汗，記錄著每一份努力。但這從不是某單個人的廝殺，或是哪一個民族的孤軍奮戰，而是全人類共同的征程。而今，抗癌大戰即將再次打響，這次，近年來大火的基因編輯技術 CRISPR 將會助我們一臂之力。
來自美國賓夕法尼亞大學（University of Pennsylvania）的醫療工作者們此刻正在為人類臨床試驗的開展做最後的準備，只要萬事俱備，項目就會全面啟動，此次臨床試驗主要針對多發性骨髓瘤（Multiple Myeloma）、滑膜肉瘤與黏液樣脂肪肉瘤（Synovial Sarcoma, SS；Myxoid/Round Cell Liposarcoma, MRCL）、黑色素瘤（Melanoma）的患者，而這也將成為美國首次使用 CRISPR 治療癌症的嘗試，也是除中國之外，CRISPR 在醫療領域的再次登場。
姍姍來遲的初次登場
美國東部時間本月 15 日，賓夕法尼亞大學將該項目公示在美國國家衛生研究所（National Institutes of Health，NIH）的臨床試驗（https://clinicaltrials.gov/show/NCT03399448）資訊網站上，對試驗的具體細節進行描述，本次臨床試驗按照疾病類型將分為三個組同時進行，計畫共將招募 18 名 18 歲以上患者，I 期的試驗週期為 5 年，目前受試者招募還未開啟。
圖 | 該專案的網頁資訊
實際上，早在 2016 年 6 月，美國國立衛生研究院（NIH）就已經對賓大的研究項目大開綠燈，但直到今天，吵吵嚷嚷一年多，研究人員們仍在不停的準備中，沒有完全的把握，誰都不敢拿別人的性命做豪賭。更嚴肅的是，任何一個生命的逝去都可能讓一個熱門技術經歷從天堂到地獄。
“我們目前正處於 I 期試驗開始的最後準備階段，但具體的開始時間還不確定，”賓大的發言人如是說。
圖 | Edward Stadtmauer 醫生
該項研究由 Edward Stadtmauer 醫生領銜，通過對人體免疫細胞（T 細胞）修飾編輯，使其成為癌細胞的“剋星”，識別並攻擊腫瘤細胞。為了增強治療效果，來自賓夕法尼亞大學的研究者們首先在患者體外使用基因編輯技術 CRISPR 編輯了 T 細胞中的幾個關鍵基因，使其成為無所畏懼的抗癌“戰士”，隨後在實驗室中培養增殖，最終注射回患者體內。
被刪除的一段序列是用來合成免疫檢查點抑制劑 PD-1（programmed death 1，程式性死亡受體 1）的基因，PD-1 是一種重要的免疫抑制分子，為 CD28 超家族成員。以 PD-1 為靶點的免疫調節在抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等方面均有重要的意義。
圖 | 一袋編輯過的人類 T 細胞
PD-L1（programmed cell death-Ligand 1，程式性死亡受體-配體 1）則是 PD-1 的配體，正常情形下免疫系統會對聚集在淋巴結或脾臟的外來抗原產生反應，促進具有抗原特異性的 T 細胞增殖。而當 PD-1 與 PD-L1 結合，抑制性的信號將會被傳導，最終導致 T 細胞增殖的減緩。
腫瘤細胞逃避 T 細胞摧毀的一種途徑是通過在它表面產生 PD-L1，當免疫細胞 T 細胞表面的 PD-1 識別 PD-L1 後，可以傳導抑制性信號，T 細胞就不能發現腫瘤細胞和向腫瘤細胞發出攻擊信號。
因而，當 T 細胞的 PD-1 表達被人為破壞，也就意味著免疫細胞裡容易被“策反”的忠臣被剔除了，識別腫瘤變得“快、准、狠”，T 細胞變成“智勇雙全”的神奇戰士。
另一項“破壞”工作是針對免疫細胞的 T 細胞受體（T cell receptor, TCR, TCRα, TCRβ）的，T 細胞受體是 T 細胞表面的特異性受體，負責識別由主要組織相容性複合體（MHC）所呈遞的抗原。同時，研究者們也使用慢病毒載體向 T 細胞中插入一種 T 細胞受體－NY-ESO-1，增強其對腫瘤的識別能力。
對於該項臨床試驗，團隊的 I 期目標是確定單次注射的安全劑量，並評估製造基因修飾 T 細胞的操作可行性。同時，也將監測患者在六個月內達到緩解的百分率，存活率及其他指標，預計 I 期將會有 5 年時間。
中美歐科學家們的 CRISPR 應用競賽
事實上，中國科學家們才是“第一群吃螃蟹的人”。早在 2016 年 10 月 28 日，來自四川大學的醫療團隊就已經開展了人體首例基因編輯（基於 CRISPR）的臨床試驗，該研究由四川大學華西醫院腫瘤科主任盧鈾帶領，通過從轉移性非小細胞肺癌患者血液中提取免疫細胞，利用 CRISPR 技術讓免疫細胞中負責編碼 PD-1 蛋白的基因失去活性，隨後在實驗室進行培養擴增，達到一定數量後再重新注入患者體內。此試驗共有 10 名患者參與，在治療中，醫生根據患者健康條件，分別選擇 2-4 次注射，該 I 期的臨床試驗的主要關注點同樣在於患者安全性及存活率。
圖 | 盧鈾教授
近年來，全球醫學界對中國科學家嘗試基因編輯治療疾病應用的關注確實在增加，因為我們的確領先了一小步，尤其是在使用 CRISPR技術編輯胚胎上。目前，全球已有的四例胚胎編輯實驗，中國科學家均有參與。
2015 年，來自中山大學的黃軍就教授帶領團隊首次發表編輯人類胚胎的相關論文，宣佈他們在實驗室中使用CRISPR／Cas９系統，將胚胎中地中海貧血症相關基因敲除，完成世界上“首例胚胎編輯”實驗。但事實上由於鑲嵌現象和脫靶效應，整個胚胎井沒有被完全編輯，同時以此種方式出生的孩子可能面臨未知或是無法承受的風險，因而，嚴格意義上來講，這次胚胎編輯並不能算是成功。
2016 年３月，世界上第二例人類胚胎編輯實驗同樣由中國團隊完成。來自廣州醫科大學附屬第三醫院的范勇教授利用 CRISPR／Cas系統對人類受精卵進行基因編輯，以抵制愛滋病毒感染。2017 年，廣州醫科大學附屬第三醫院劉見橋教授帶領團隊再一次完成了“世界首次”一將 CRISPR初次應用於人類二倍體胚胎，在胚胎層面對攜帶遺傳突變基因的胚胎進行修復。
2017年８月，《 Nature》雜誌發文介紹了美國首例基因編輯人類胚胎的研究，該項研究由來自於俄勒岡健康與科學大學的 Shoukhratb Mitallpov團隊完成，團隊中同樣有中國科學家的身影。他們通過 CRISPR／Cas９技術鎖定並移除了42 個胚胎內肥厚型心肌病有關的變異基因。
儘管將 CRISPR 技術應用到胚胎編輯上仍充滿爭議，但是，各國的科學家並不會因此停止探索其應用邊界的腳步。事實上，在 CRISPR 技術發明之前，許多研究人員已經看見了基因編輯在治療各類疾病中不可限量的前景。而隨著CRISPR 技術的引入，這種更為簡單、高效、準確的基因編輯技術將使基因療法進入臨床階段的時間大大提前。
而歐洲自然也希望在 CRISPR 的疾病應用上分一杯羹。預計今年晚些時候，歐洲也將開展其首個 CRISPR 臨床試驗，同樣，他們也將選擇體外修飾增殖後注射回患者體內的方法。
“醫療競爭的號角已然吹響，類似當年的美蘇太空競賽，只不過這次是在生物醫療領域的爭奪。這種競爭之所以重要，是因為良性競爭會不斷提升技術和終端產品的可靠性”，美國腫瘤細胞免疫療法的先驅者，同時也是一個重大基因療法科研計畫的科學顧問的卡爾·朱恩教授表示。
圖丨George Church（圖片來自DT君）
在DT君此前的一次獨家專訪中，哈佛大學著名教授 George Church 說：“我倒不覺得“軍備競賽”是個恰當的比喻，我認為更像是當年的‘電子產業革命’，具體說來就是加州的電子產業與日韓等國的競爭。只要有人通過創新領先一步，其他人就要奮起直追，這其實更多的是一種相互促進的合作機制。”
George Church 還表示，無論如何，中美兩國都將成為全球基因技術的領軍者。“世界上其他國家和地區相比就比較“落後”了。歐洲人由於太害怕基因改造生物（GMO）而裹足不前，其他國家取得的進展也有限。中美兩國我認為在未來更多的會是合作而不是競爭”，他說。
總而言之，看似平靜的湖面已經吹起陣陣漣漪，在這場關於應用 CRISPR 征服癌症等疾病的大戰中，中美歐中誰將領先一步，我們拭目以待。
歷史性進展！CRISPR與幹細胞聯姻：單基因開啟普通細胞逆轉為幹細胞之路！文章中啟動特定基因的CRISPR系統
幹細胞是搖籃，孕育了其他各種功能的細胞。那麼如何獲取和製造大量的幹細胞呢？以前我們會通過轉錄因數和一些化學物質誘導普通細胞轉變為幹細胞。然而，今天，我們看到了幹細胞領域的重大突破：單個基因即可實現普通細胞逆轉為幹細胞！
多能幹細胞可以轉化為體內的任何細胞類型。因此，它們是目前無法治癒的疾病——如心力衰竭、帕金森病和失明症的關鍵治療資源。同時他們也可以作為重要的模型進行藥物的實驗。
目前誘導普通細胞轉化為幹細胞的方法主要有2種：第一種是通過轉錄因數的添加實現細胞關鍵信號的開閉，從而實現普通細胞的逆襲，而這個突破也讓發現者榮登了諾貝爾獎的寶座；而另一種則是利用一些化學的分子組合實現普通細胞轉化為幹細胞。
而在《Cell Stem Cell》上面的這篇文章則揭示了誘導普通細胞轉化為幹細 胞的第3種方法！這篇名為“CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency”的文章，揭示了CRISPR可以啟動細胞中的兩個特定基因，從而實現普通細胞的逆襲！
文章網址：http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(17)30501-5
技術的發展推動的往往不是一個領域的發展，而是多領域的共同進步。CRISPR和幹細胞的聯姻，讓我們看到了不一樣的世界。
在此之前的研究中，研究人員已經確定了幹細胞表達的兩個關鍵基因：Sox2和Oct4。這兩個基因和獲得諾貝爾獎的轉錄因數相似，都是誘導幹細胞分化和關閉的基因。而在進一步的研究中，研究人員發現：只要對Sox2和Oct4基因中任何一個基因進行啟動（或關閉），就可以實現普通細胞逆襲之路，最終轉化為幹細胞！
研究的主要作者丁勝博士說道：“在研究最初始的時候，我們只是嘗試性的進行研究，確認是否有可能。然而實驗結果大大出乎了我們的意料——單基因實現普通細胞逆轉成幹細胞確實可行！”
當然，基因是一個牽一髮而動全身的過程，至於為什麼撥弄這一根弦就能奏出美妙樂曲的原因，還有待我們探索。
同樣的病毒再次入侵時細菌就有了抗性，使其免遭攻擊。同時人為地去除或添加特定的間隔區序列，會影響細菌的抗性表型。因此，他們認為CRISPR及cas基因一起為嗜熱鏈球菌提供了對噬菌體的抗性作用，同時抗性的特異性取決於CRISPR中的間隔區序列，細菌的這種免疫性是可以遺傳的。至此，雖然科學家並不清楚CRISPR/Cas抵抗病毒的具體機制，但他們開始逐漸揭開其神秘的面紗。2008年，Oost實驗室揭示了宿主細胞中CRISPR的間隔序列如何在cas蛋白的協助下介導發揮抗病毒作用。他們發現在CRISPR轉錄後，cas蛋白會形成一個稱為Cascade的複合物，裂解每個重複單元中的CRISPR RNA前體（pre-crRNA），但裂解產物都保留了間隔序列。在解旋酶cas3的作用下，成熟的CRISPR RNA(crRNA)發揮小嚮導RNA（small guide RNA）的角色，促使Cascade干預病毒的增殖。2009年，Mojica團隊指出前間隔序列臨近的PAM序列為原核生物中CRISPR/Cas發揮免疫識別提供了靶標。
2011年，Charpentier研究組通過對人類病原體化膿性鏈球菌的差異化RNA測序，揭示了反式編碼crRNA（tracrRNA）參與pre-crRNA的加工成熟過程。他們指出，tracrRNA通過24個核苷酸與pre-crRNA中的重複序列互補配對，在保守的內源性RNA酶III和CRISPR相關的Csn1蛋白的參與下指導pre-cr RNA的成熟過程，這些組分對保護化膿性鏈球菌免受噬菌體DNA的入侵必不可少，研究揭示了crRNA成熟的新途徑。
以上我們一直在介紹CRISPR/Cas的發現及細菌、古細菌如何利用該系統來沉默外來核酸以抵禦病毒及質粒的入侵。CRISPR/Cas作為基因編輯系統被應用最早開始於2012年兩位女神的強強聯合，她們分別是來自加州大學伯克利分校的結構生物學家詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）和瑞典于默真大學的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）。她們通過體外實驗證明：成熟的crRNA通過堿基互補配對與tracrRNA形成特殊的雙鏈RNA結構，指導cas9蛋白在目標DNA上引起雙鏈斷裂。在與crRNA指導序列互補的位點，cas9蛋白的HNH核酸酶結構域切割crRNA的互補鏈，而cas9蛋白RuvC樣結構域切割非互補鏈。當雙tracrRNA：crRNA被嵌合到一條RNA時，同樣可以指導cas9切割雙鏈DNA。她們的研究證明，在雙鏈RNA指導下切割雙鏈DNA斷裂的內切酶家族並揭示了CRISPR/Cas系統在RNA指導下進行基因編輯的巨大潛力。
►CRISPR/Cas系統發現歷程中的主要貢獻者
之後就一發不可收拾，緊接著是2013年初的兩篇Science和一篇Cell文章，它們分別由來自于哈佛大學醫學院的George Church、麻省理工學院博多研究所的張鋒以及加州大學三藩市分校系統及合成生物學中心的Lei S. Qi（目前就職於斯坦福大學）實驗室，這三篇文章都將CRISPR/Cas系統成功應用到哺乳動物細胞中。其中Church研究組設計了II型CRISPR/Cas系統，在人類細胞中設計特定的gRNA。對於內源性AAVS1基因座，他們成功獲得了293T細胞中10％至25％，K562細胞中13％至8％以及誘導多能幹細胞中2％至4％的靶向率。他們同時表明這個過程依賴於CRISPR元件，是特定的序列；在同時引入多個gRNA時，可以實現對目標基因座的多重編輯。張鋒實驗室證實了cas9可以在小RNA的指導下在人類及小鼠細胞中對內源基因座實現精確切割，同時他們將cas9改造為缺口酶促進同源修復。Qi與同事則將II型CRISPR/Cas系統中的cas9蛋白改造成失去核酸內切酶活性的dCas9，將其與gRNA共表達，產生一種DNA識別複合物使其特異性地干擾轉錄延伸，RNA聚合酶或轉錄因數與DNA的結合達到抑制目標基因表達的目的。他們將其稱為CRISPRi，實現了對大腸桿菌中基因的有效抑制，且沒有明顯的脫靶效應。而且可以實現同時抑制多個基因，他們表明CRISPRi也適用於哺乳動物細胞。很快人們利用CRISPR/Cas系統實現了對斑馬魚、真菌及細菌的基因編輯。2013年5月，Jaenisch研究組利用CRISPR/Cas介導的基因工程技術製造了在多個基因上含有多重突變的小鼠，極大地促進了體內多基因的功能學研究。隨後，人們實現了對果蠅、線蟲、大鼠、豬、羊、以及水稻、小麥、高粱等多種生物的基因編輯。
►基因編輯技術的基本原理，圖片來自origene.com
距開始利用CRISPR/Cas進行基因編輯不到一年時間裡，人們就實現了用該系統來校正遺傳疾病。2013年12月，李勁松研究組和Hans Clevers研究組利用CRISPR/Cas9系統分別校正了小鼠白內障及人幹細胞中一種與囊腫性纖維化相關聯的基因缺陷。同時，研究者通過向人類細胞轉染慢病毒包裝的sgRNA庫，實現了對基因組範圍的功能性篩選。2015年4月，黃軍就和團隊首次修飾人類胚胎DNA，為治療一種在中國南方兒童中常見的遺傳病——地中海貧血症提供了可能。
隨著對CRISPR系統研究的不斷深入，也暴露了一定的缺陷和局限性，如嚴重的脫靶效應。2015年9月，張鋒研究組報導了一種不同於Cas9的新型2類CRISPR效應因數Cpf1。他們的研究證明，Cpf1是一種不依賴tracrRNA，由單個RNA介導的核酸內切酶。Cas9是在同一個位置同時剪切DNA分子的雙鏈，形成的是平末端；而Cpf1剪切後形成是兩個不同長度的鏈，被稱之為黏性末端。同時Cpf1能夠識別富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列，可以擴展CRISPR的編輯範圍。
已知的許多遺傳疾病由點突變引起，然而目前糾正點突變的方法存在效率低或引起隨機缺失或插入等缺陷。2016年4月，David R. Liu研究組報導了一種堿基編輯的新方法。他們將胞嘧啶脫氨酶與CRISPR/Cas9進行融合，在gRNA的指導下，不引起DNA雙鏈斷裂，直接實現胞嘧啶（C）到尿嘧啶（U）的轉變，而DNA複製進一步使得U被T代替，從而實現C→T (or G→A)的轉換。這種堿基編輯器可有效糾正多種與人類疾病相關的點突變。他們還發展了第二、第三代堿基編輯技術，進一步提高堿基編輯效率。在此基礎上，上海科技大學陳佳研究組與合作者共同開發了一種增強型堿基編輯器。他們發現，將含有尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(UGI)的質粒與sgRNA/BE3共同轉染293FT細胞，經深度測序分析，與單獨轉染sgRNA/BE3相比，共轉染的方法減低了錯配頻率並提高了C-到T-的替換效率。他們還發現UGI的表達水準與C-到T-的堿基替換效率成正相關。為了提高實驗的方便性，研究者還將多個重複UGI與BE共表達在同一載體，與靶向不同基因座的多個sgRNA共同轉染293FT細胞，結果表明這種增強型堿基編輯器大大提高了編輯效率。
2016年6月，張鋒研究組發現一種來自纖毛菌（Leptotrichia shahii）的效應因數C2c2（現被稱為cas13a），具有RNA介導的RNA酶功能。體外生化分析顯示C2c2可在單個crRNA指導下剪切靶向單鏈RNA。細菌內，C2c2可被用來敲低特異性的mRNA，RNA酶活性依賴於HEPN結構域，C2c2是第一個被發現的靶向RNA的CRISPR效應因數。
2016年10月，第一個由CRISPR/Cas9編輯進行的臨床治療實驗由Lu團隊完成，研究者分離患有轉移性非小細胞肺癌病人血液中的免疫細胞，特異性的敲除PD-1基因，對細胞擴增培養後輸回患者體內以期抵抗癌症。
2017年10月，David R. Liu團隊將編碼tRNA腺嘌呤脫氨酶(TadA)的基因引入大腸桿菌內，經歷了漫長的7代篩選後，開發出了一款全新的“堿基編輯器”，將進化後的TadA與CRISPR/Cas9系統融合，在不引起DNA鏈斷裂的情況下實現了A•T到G•C的轉換，且在人體細胞中，編輯效率超過了50%。這樣就實現了C•G 到 T•A和A•T 到G•C的高效編輯，為多種遺傳疾病的治療提供了有效工具。
重大里程碑：美“魔剪”抗癌首例人體實驗將在賓大進行！當年的太空競賽正在 CRISPR 應用上重演，中美醫療競爭號角已吹響
數十年來，人類從未停止過與癌症的抗爭，血、淚、汗，記錄著每一份努力。但這從不是某單個人的廝殺，或是哪一個民族的孤軍奮戰，而是全人類共同的征程。而今，抗癌大戰即將再次打響，這次，近年來大火的基因編輯技術 CRISPR 將會助我們一臂之力。
來自美國賓夕法尼亞大學（University of Pennsylvania）的醫療工作者們此刻正在為人類臨床試驗的開展做最後的準備，只要萬事俱備，項目就會全面啟動，此次臨床試驗主要針對多發性骨髓瘤（Multiple Myeloma）、滑膜肉瘤與黏液樣脂肪肉瘤（Synovial Sarcoma, SS；Myxoid/Round Cell Liposarcoma, MRCL）、黑色素瘤（Melanoma）的患者，而這也將成為美國首次使用 CRISPR 治療癌症的嘗試，也是除中國之外，CRISPR 在醫療領域的再次登場。
姍姍來遲的初次登場
美國東部時間本月 15 日，賓夕法尼亞大學將該項目公示在美國國家衛生研究所（National Institutes of Health，NIH）的臨床試驗（https://clinicaltrials.gov/show/NCT03399448）資訊網站上，對試驗的具體細節進行描述，本次臨床試驗按照疾病類型將分為三個組同時進行，計畫共將招募 18 名 18 歲以上患者，I 期的試驗週期為 5 年，目前受試者招募還未開啟。
圖 | 該專案的網頁資訊
實際上，早在 2016 年 6 月，美國國立衛生研究院（NIH）就已經對賓大的研究項目大開綠燈，但直到今天，吵吵嚷嚷一年多，研究人員們仍在不停的準備中，沒有完全的把握，誰都不敢拿別人的性命做豪賭。更嚴肅的是，任何一個生命的逝去都可能讓一個熱門技術經歷從天堂到地獄。
“我們目前正處於 I 期試驗開始的最後準備階段，但具體的開始時間還不確定，”賓大的發言人如是說。
圖 | Edward Stadtmauer 醫生
該項研究由 Edward Stadtmauer 醫生領銜，通過對人體免疫細胞（T 細胞）修飾編輯，使其成為癌細胞的“剋星”，識別並攻擊腫瘤細胞。為了增強治療效果，來自賓夕法尼亞大學的研究者們首先在患者體外使用基因編輯技術 CRISPR 編輯了 T 細胞中的幾個關鍵基因，使其成為無所畏懼的抗癌“戰士”，隨後在實驗室中培養增殖，最終注射回患者體內。
被刪除的一段序列是用來合成免疫檢查點抑制劑 PD-1（programmed death 1，程式性死亡受體 1）的基因，PD-1 是一種重要的免疫抑制分子，為 CD28 超家族成員。以 PD-1 為靶點的免疫調節在抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等方面均有重要的意義。
圖 | 一袋編輯過的人類 T 細胞
PD-L1（programmed cell death-Ligand 1，程式性死亡受體-配體 1）則是 PD-1 的配體，正常情形下免疫系統會對聚集在淋巴結或脾臟的外來抗原產生反應，促進具有抗原特異性的 T 細胞增殖。而當 PD-1 與 PD-L1 結合，抑制性的信號將會被傳導，最終導致 T 細胞增殖的減緩。
腫瘤細胞逃避 T 細胞摧毀的一種途徑是通過在它表面產生 PD-L1，當免疫細胞 T 細胞表面的 PD-1 識別 PD-L1 後，可以傳導抑制性信號，T 細胞就不能發現腫瘤細胞和向腫瘤細胞發出攻擊信號。
因而，當 T 細胞的 PD-1 表達被人為破壞，也就意味著免疫細胞裡容易被“策反”的忠臣被剔除了，識別腫瘤變得“快、准、狠”，T 細胞變成“智勇雙全”的神奇戰士。
另一項“破壞”工作是針對免疫細胞的 T 細胞受體（T cell receptor, TCR, TCRα, TCRβ）的，T 細胞受體是 T 細胞表面的特異性受體，負責識別由主要組織相容性複合體（MHC）所呈遞的抗原。同時，研究者們也使用慢病毒載體向 T 細胞中插入一種 T 細胞受體－NY-ESO-1，增強其對腫瘤的識別能力。
對於該項臨床試驗，團隊的 I 期目標是確定單次注射的安全劑量，並評估製造基因修飾 T 細胞的操作可行性。同時，也將監測患者在六個月內達到緩解的百分率，存活率及其他指標，預計 I 期將會有 5 年時間。
中美歐科學家們的 CRISPR 應用競賽
事實上，中國科學家們才是“第一群吃螃蟹的人”。早在 2016 年 10 月 28 日，來自四川大學的醫療團隊就已經開展了人體首例基因編輯（基於 CRISPR）的臨床試驗，該研究由四川大學華西醫院腫瘤科主任盧鈾帶領，通過從轉移性非小細胞肺癌患者血液中提取免疫細胞，利用 CRISPR 技術讓免疫細胞中負責編碼 PD-1 蛋白的基因失去活性，隨後在實驗室進行培養擴增，達到一定數量後再重新注入患者體內。此試驗共有 10 名患者參與，在治療中，醫生根據患者健康條件，分別選擇 2-4 次注射，該 I 期的臨床試驗的主要關注點同樣在於患者安全性及存活率。
圖 | 盧鈾教授
近年來，全球醫學界對中國科學家嘗試基因編輯治療疾病應用的關注確實在增加，因為我們的確領先了一小步，尤其是在使用 CRISPR技術編輯胚胎上。目前，全球已有的四例胚胎編輯實驗，中國科學家均有參與。
2015 年，來自中山大學的黃軍就教授帶領團隊首次發表編輯人類胚胎的相關論文，宣佈他們在實驗室中使用CRISPR／Cas９系統，將胚胎中地中海貧血症相關基因敲除，完成世界上“首例胚胎編輯”實驗。但事實上由於鑲嵌現象和脫靶效應，整個胚胎井沒有被完全編輯，同時以此種方式出生的孩子可能面臨未知或是無法承受的風險，因而，嚴格意義上來講，這次胚胎編輯並不能算是成功。
2016 年３月，世界上第二例人類胚胎編輯實驗同樣由中國團隊完成。來自廣州醫科大學附屬第三醫院的范勇教授利用 CRISPR／Cas系統對人類受精卵進行基因編輯，以抵制愛滋病毒感染。2017 年，廣州醫科大學附屬第三醫院劉見橋教授帶領團隊再一次完成了“世界首次”一將 CRISPR初次應用於人類二倍體胚胎，在胚胎層面對攜帶遺傳突變基因的胚胎進行修復。
2017年８月，《 Nature》雜誌發文介紹了美國首例基因編輯人類胚胎的研究，該項研究由來自於俄勒岡健康與科學大學的 Shoukhratb Mitallpov團隊完成，團隊中同樣有中國科學家的身影。他們通過 CRISPR／Cas９技術鎖定並移除了42 個胚胎內肥厚型心肌病有關的變異基因。
儘管將 CRISPR 技術應用到胚胎編輯上仍充滿爭議，但是，各國的科學家並不會因此停止探索其應用邊界的腳步。事實上，在 CRISPR 技術發明之前，許多研究人員已經看見了基因編輯在治療各類疾病中不可限量的前景。而隨著CRISPR 技術的引入，這種更為簡單、高效、準確的基因編輯技術將使基因療法進入臨床階段的時間大大提前。
而歐洲自然也希望在 CRISPR 的疾病應用上分一杯羹。預計今年晚些時候，歐洲也將開展其首個 CRISPR 臨床試驗，同樣，他們也將選擇體外修飾增殖後注射回患者體內的方法。
“醫療競爭的號角已然吹響，類似當年的美蘇太空競賽，只不過這次是在生物醫療領域的爭奪。這種競爭之所以重要，是因為良性競爭會不斷提升技術和終端產品的可靠性”，美國腫瘤細胞免疫療法的先驅者，同時也是一個重大基因療法科研計畫的科學顧問的卡爾·朱恩教授表示。
圖丨George Church（圖片來自DT君）
在DT君此前的一次獨家專訪中，哈佛大學著名教授 George Church 說：“我倒不覺得“軍備競賽”是個恰當的比喻，我認為更像是當年的‘電子產業革命’，具體說來就是加州的電子產業與日韓等國的競爭。只要有人通過創新領先一步，其他人就要奮起直追，這其實更多的是一種相互促進的合作機制。”
George Church 還表示，無論如何，中美兩國都將成為全球基因技術的領軍者。“世界上其他國家和地區相比就比較“落後”了。歐洲人由於太害怕基因改造生物（GMO）而裹足不前，其他國家取得的進展也有限。中美兩國我認為在未來更多的會是合作而不是競爭”，他說。
總而言之，看似平靜的湖面已經吹起陣陣漣漪，在這場關於應用 CRISPR 征服癌症等疾病的大戰中，中美歐中誰將領先一步，我們拭目以待。
歷史性進展！CRISPR與幹細胞聯姻：單基因開啟普通細胞逆轉為幹細胞之路！文章中啟動特定基因的CRISPR系統
幹細胞是搖籃，孕育了其他各種功能的細胞。那麼如何獲取和製造大量的幹細胞呢？以前我們會通過轉錄因數和一些化學物質誘導普通細胞轉變為幹細胞。然而，今天，我們看到了幹細胞領域的重大突破：單個基因即可實現普通細胞逆轉為幹細胞！
多能幹細胞可以轉化為體內的任何細胞類型。因此，它們是目前無法治癒的疾病——如心力衰竭、帕金森病和失明症的關鍵治療資源。同時他們也可以作為重要的模型進行藥物的實驗。
目前誘導普通細胞轉化為幹細胞的方法主要有2種：第一種是通過轉錄因數的添加實現細胞關鍵信號的開閉，從而實現普通細胞的逆襲，而這個突破也讓發現者榮登了諾貝爾獎的寶座；而另一種則是利用一些化學的分子組合實現普通細胞轉化為幹細胞。
而在《Cell Stem Cell》上面的這篇文章則揭示了誘導普通細胞轉化為幹細 胞的第3種方法！這篇名為“CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency”的文章，揭示了CRISPR可以啟動細胞中的兩個特定基因，從而實現普通細胞的逆襲！
文章網址：http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(17)30501-5
技術的發展推動的往往不是一個領域的發展，而是多領域的共同進步。CRISPR和幹細胞的聯姻，讓我們看到了不一樣的世界。
在此之前的研究中，研究人員已經確定了幹細胞表達的兩個關鍵基因：Sox2和Oct4。這兩個基因和獲得諾貝爾獎的轉錄因數相似，都是誘導幹細胞分化和關閉的基因。而在進一步的研究中，研究人員發現：只要對Sox2和Oct4基因中任何一個基因進行啟動（或關閉），就可以實現普通細胞逆襲之路，最終轉化為幹細胞！
研究的主要作者丁勝博士說道：“在研究最初始的時候，我們只是嘗試性的進行研究，確認是否有可能。然而實驗結果大大出乎了我們的意料——單基因實現普通細胞逆轉成幹細胞確實可行！”
當然，基因是一個牽一髮而動全身的過程，至於為什麼撥弄這一根弦就能奏出美妙樂曲的原因，還有待我們探索。