復旦大學最新研究揭示：舞蹈症致病蛋白毒性可能從哪裡來？
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撰文｜越君
責編｜李娟
知識份子為更好的智趣生活ID：The-Intellectual
還記得幾年前火遍全球社交網路的“冰桶挑戰”嗎？那次活動讓人們瞭解到一種神經病變，即“漸凍人症”。與廣為人知的老年癡呆症和帕金森病一樣，這類疾病都屬於神經退行性疾病（Neurodegenerative Disorders），是由於大腦和脊髓中的神經細胞功能衰退所致。因為人體的所有運動，包括說話、吞咽以及呼吸肌的活動等，都是由運動神經細胞支配，一旦神經細胞失去正常功能，帶來的就是這類足以讓人崩潰的疾病。
在神經退行性疾病中，還有一種疾病格外引起科學家的注意——亨廷頓病（Huntingtin Disease），又稱舞蹈症，因發病者肢體像跳舞般不受控運動而得名。亨廷頓病與其他同類疾病有個共同點，都是由致病蛋白質在神經細胞裡的異常積累所引起。比如，亨廷頓病的致病蛋白是由變異HTT基因編碼的HTT蛋白。該疾病之所以讓很多科學家頗感興趣，還因為亨廷頓病還有其獨特之處。
首先，亨廷頓病是遺傳病，單一基因HTT的突變就足以引發該病。這種單基因遺傳的性質有利於對其致病機理的探索，基於此，科學家建立了相對可靠的疾病遺傳學模型，進而嚴密地證明了HTT致病蛋白積累與該病的因果關聯。
其次，致病基因HTT的突變很特別。與單個核苷酸突變引起的遺傳病不同，HTT基因突變是一段三核苷酸重複序列的重複數改變。具體來說，
這裡有一個非常重要又有趣的問題，HTT蛋白本來不具有毒性，甚至是胚胎發育所必須的蛋白[2]，為什麼該蛋白的polyQ長度超過一定閾值就產生毒性，
科學家提出了兩個模型嘗試對此問題作出解釋。
第一個模型被稱為線性格柵模型（Linear Lattice Model）。科學家認為，polyQ長鏈好似鋪有整齊枕木的鐵軌，由相同的結構單元組成，“枕木”之間的結構單元可能本身就自帶毒性（intrinsictoxicity），polyQ越長，蛋白的細胞毒性越強，達到一定程度就會造成疾病。簡單來說，即polyQ中具有線性排列的含有內在毒性的結構單元。
有哪些證據支援該模型呢？首先，體外生化實驗和結構生物學的研究發現，polyQ的抗體可以與很短的polyQ片段（10Q）結合[3,4]，而不同polyQ抗體與野生型短polyQ以及突變型長polyQ的結合模式相同[3,4]。這提示polyQ長鏈是由相同的結構單元組成。其次，有關蛋白功能的研究顯示，病人的發病年齡與polyQ長度有關，polyQ越長，病人的發病年齡總體來說越早[1]。另有研究表明，如果把小鼠Htt基因的7個CAG重複完全刪除，小鼠不但沒有出現缺陷，反而延緩了衰老，變得更健康了[5]。
然而，該模型仍然很難解釋為何增長的polyQ會突然產生嚴重毒性，較短的polyQ卻完全正常。而且，相關體外實驗也無法反映細胞中的情況，因為細胞內的polyQ可能具有多種不同構象。
於是，有科學家提出了第二個可能的解釋——毒性浮現構象模型（Emergent Conformation），即變異蛋白的polyQ長度達到一定閾值之後，會出現與“整齊的枕木”不同的新的構象單元，而這種新的構象單元是導致神經毒性的主要原因。這種解釋並沒有否定線性格柵模型，只是推測除了線性格柵構象之外，polyQ長鏈上還出現了真正具有毒性的“浮現構象”，因此是多種構象的混合（圖1，摘自參考文獻[6]）。
圖1 解釋變異毒性蛋白HTT中polyQ長鏈構象的線性格柵模型（Linear lattice）與毒性構象浮現模型(Emergent conformation)。[6]
毒性浮現模型的支援證據相對來說非常間接，主要是基於不同polyQ抗體識別的變異HTT蛋白信號與細胞毒性的相關性不同，因此推測變異HTT蛋白過長的polyQ具有多種構象，其中包括了最具毒性的“浮現構象”[6]。這裡相關性的計算基於很多非直觀的假設，缺乏更直接的證據，被不少研究反對[4,7]。
由此可以看出，以上兩種觀點最大的爭議在於，變異蛋白中過長的polyQ是否存在多種不同的構象，也就是構象是否存在“多態性”。
這可能是生物化學的一個根本問題。因為我們知道，蛋白質的三維結構由該蛋白質的氨基酸序列所決定，這被稱為Anfinsen法則（Anfinsen’s Dogma），並獲得1972年的諾貝爾獎。該法則也是結構生物學的基礎，因為結構生物學的研究基於這樣的假設：蛋白質在特定體外條件下的三維結構與細胞內的三維結構相同。
然而，有不少蛋白會“錯誤折疊”（misfolding）並產生不同的構象。在神經退行性疾病中，“錯誤折疊”的蛋白容易聚集在一起並最終形成蛋白沉澱。那麼，可溶性蛋白質的單體是否也會違背Anfinsen法則，通過“錯誤折疊”產生多種不同的構象，進而產生不同的毒性，最終導致疾病呢？目前還沒有答案。而且，如果真的存在“多態性”，為什麼其中某些構象的毒性會更高？這也是關於疾病致病機制的根本性問題。
但是研究上述問題很難。變異HTT蛋白非常大（>300kDa），結構難於解析。即使可以解析，目前結構生物學的手段無法在細胞非變性條件下解析特定目標蛋白的精細結構，而體外純化的條件下則可能無法獲得蛋白折疊的各種構象，更加無法進一步證明各種構象可能的功能（毒性）差異。
用“蛋白質降解”來探尋答案2017年9月4日，Nature Chemical Biology線上發表了一篇論文[8]，由復旦大學魯伯塤課題組完成，該論文從一個嶄新的角度研究上述問題：蛋白質降解。
細胞中，新蛋白質在不斷地合成，完成功能的或者“錯誤折疊”的蛋白質則被不斷地降解，生成小的肽段或氨基酸。主要有兩個可能的因素影響蛋白降解速率：蛋白構象和蛋白功能。
一方面，蛋白構象很可能影響其降解速率，如果同類細胞的同一蛋白有著不同的降解速率，意味著該蛋白存在不同的構象；另一方面，蛋白降解是蛋白功能的終極調控。已有資料表明，疾病蛋白的降解速率與其神經毒性呈非常顯著的負相關，即致病蛋白降解越慢，其毒性越大[9]。因此，瞭解蛋白本身是否具有構象的“多態性”，以及不同構象蛋白的毒性是否具有“多態性”，都可以從研究蛋白的降解速率入手。如果不同polyQ抗體識別的HTT蛋白的降解速率不同，則證明的確存在不同構象，而且降解速率較慢的構象的毒性可能較大。
為了檢測以上假說，魯伯塤課題組測得了同一組樣品中被不同polyQ抗體（主要有MW1和3B5H10兩種）所識別的HTT蛋白的降解速率。他們所使用的測量方法被稱為CH-chase，是基於點擊化學（Click Chemistry）和均相時間分辨螢光（HTRF）技術而建立的。
首先，他們選用的細胞模型是病人的真皮成纖維細胞，這是因為該細胞中有全長的變異HTT蛋白，並且檢測不到寡聚體或多聚體，排除了可能的干擾因素，進而只檢測可溶性HTT蛋白單體的降解。研究顯示，在三種不同的病人真皮成纖維細胞中，polyQ抗體3B5H10所識別的HTT的降解速率顯著低於另一種polyQ抗體（MW1）所識別的HTT的降解速率，從而直接證明了不同polyQ構象的存在。這種降解速率差異在過表達的體系中一樣可以被檢測到。有趣的是，這種差異只在過長的polyQ（46Q，72Q，100Q）中存在，在野生型長度的polyQ（18Q及23Q）中並沒有檢測到，從而證明了過長的polyQ出現了“浮現構象”，因此產生了“多態性”。
那麼，是什麼因素減慢了這類HTT蛋白的降解速率呢？魯伯塤課題組的進一步研究發現，導致3B5H10抗體所識別的HTT蛋白的降解顯著變慢的原因，是因為其能夠抵抗自噬作用。
自噬（Autophagy）是細胞清除蛋白的重要手段，自噬小泡包裹住蛋白，並將其運送至溶酶體完成降解。自噬分子機制的發現獲得了2016年的諾貝爾獎。傳統觀點認為，自噬作用是非選擇性地，能隨機清除任何蛋白。然而近年研究發現，有些自噬過程中，自噬小泡會利用自噬受體蛋白p62或NBR1等有選擇性地吞噬特定的蛋白，這個過程稱為選擇性自噬。
魯伯塤課題組的研究發現，在病人細胞、小鼠大腦組織乃至病人大腦組織中，變異HTT蛋白的賴氨酸63型泛素化幾乎缺失，因此無法被選擇性自噬受體蛋白p62所識別，也就無法被選擇性自噬降解。這就解釋了為何這種HTT構象降解速度顯著變慢（圖2）。
圖2 亨廷頓致病蛋白HTT的polyQ長鏈有多種構象，其中具有毒性的構象蛋白比野生型蛋白降解得要慢，因為它無法被自噬小泡包裹而進行快速降解，這也可能是其產生更高神經毒性的原因。
這項最新研究揭示了導致亨廷頓疾病的變異蛋白HTT的polyQ長鏈存在多種不同的構象，並因此導致了不同的降解速率，產生了不同的毒性。這種“多態性”可能補充了對“Anfinsen法則”的認識。同時，該研究進一步明確了選擇性自噬作用的機制，發現選擇性自噬比之前認為的要更具選擇性：它不僅能識別特定的蛋白進行降解，甚至能識別同一蛋白的不同構象。
該研究在疾病研究領域也有重要意義，不僅刷新了科學家對疾病機制的認識，而且提供了治療疾病的新思路。例如，可尋找化合物迫使疾病蛋白從慢速降解的構象轉變為快速降解的構象，達到治療疾病的目的。不過，仍然有幾個關鍵問題亟待解答，比如，為何polyQ構象的改變會影響HTT的泛素化以及選擇性自噬的識別，其他polyQ蛋白是否具有類似的性質等，值得後續研究。
參考文獻
1.Walker, F.O., Huntington's disease. Lancet, 2007. 369(9557): p. 218-28.
2.Nasir, J., et al., Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell, 1995. 81(5): p. 811-23.
3.Li, P., et al., The structure of a polyQ-anti-polyQ complex reveals binding according to a linear lattice model. Nat Struct Mol Biol, 2007. 14(5): p. 381-7.
4.Klein, F.A., et al., Linear and extended: a common polyglutamine conformation recognized by the three antibodies MW1, 1C2 and 3B5H10. Hum Mol Genet, 2013. 22(20): p. 4215-23.
5.Zheng, S., et al., Deletion of the huntingtin polyglutamine stretch enhances neuronal autophagy and longevity in mice. PLoS Genet, 2010. 6(2): p. e1000838.
6.Miller, J., et al., Identifying polyglutamine protein species in situ that best predict neurodegeneration. Nat Chem Biol, 2011. 7(12): p. 925-34.
7.Owens, G.E., et al., Anti-PolyQ Antibodies Recognize a Short PolyQ Stretch in Both Normal and Mutant Huntingtin Exon 1. J Mol Biol, 2015. 427(15): p. 2507-19.
8.Fu, Y.W., P. Pan, Y. Sun, X, Yang, H. Difiglia, M. Lu, B., A toxic mutant huntingtin species is resistant to selective autophagy. Nature Chemical Biology, 2017.
9.Tsvetkov, A.S., et al., Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nat Chem Biol, 2013. 9(9): p. 586-92.
製版編輯： 許逸｜
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小鼠不但沒有出現缺陷，反而延緩了衰老，變得更健康了[5]。然而，該模型仍然很難解釋為何增長的polyQ會突然產生嚴重毒性，較短的polyQ卻完全正常。而且，相關體外實驗也無法反映細胞中的情況，因為細胞內的polyQ可能具有多種不同構象。
於是，有科學家提出了第二個可能的解釋——毒性浮現構象模型（Emergent Conformation），即變異蛋白的polyQ長度達到一定閾值之後，會出現與“整齊的枕木”不同的新的構象單元，而這種新的構象單元是導致神經毒性的主要原因。這種解釋並沒有否定線性格柵模型，只是推測除了線性格柵構象之外，polyQ長鏈上還出現了真正具有毒性的“浮現構象”，因此是多種構象的混合（圖1，摘自參考文獻[6]）。
圖1 解釋變異毒性蛋白HTT中polyQ長鏈構象的線性格柵模型（Linear lattice）與毒性構象浮現模型(Emergent conformation)。[6]
毒性浮現模型的支援證據相對來說非常間接，主要是基於不同polyQ抗體識別的變異HTT蛋白信號與細胞毒性的相關性不同，因此推測變異HTT蛋白過長的polyQ具有多種構象，其中包括了最具毒性的“浮現構象”[6]。這裡相關性的計算基於很多非直觀的假設，缺乏更直接的證據，被不少研究反對[4,7]。
由此可以看出，以上兩種觀點最大的爭議在於，變異蛋白中過長的polyQ是否存在多種不同的構象，也就是構象是否存在“多態性”。
這可能是生物化學的一個根本問題。因為我們知道，蛋白質的三維結構由該蛋白質的氨基酸序列所決定，這被稱為Anfinsen法則（Anfinsen’s Dogma），並獲得1972年的諾貝爾獎。該法則也是結構生物學的基礎，因為結構生物學的研究基於這樣的假設：蛋白質在特定體外條件下的三維結構與細胞內的三維結構相同。
然而，有不少蛋白會“錯誤折疊”（misfolding）並產生不同的構象。在神經退行性疾病中，“錯誤折疊”的蛋白容易聚集在一起並最終形成蛋白沉澱。那麼，可溶性蛋白質的單體是否也會違背Anfinsen法則，通過“錯誤折疊”產生多種不同的構象，進而產生不同的毒性，最終導致疾病呢？目前還沒有答案。而且，如果真的存在“多態性”，為什麼其中某些構象的毒性會更高？這也是關於疾病致病機制的根本性問題。
但是研究上述問題很難。變異HTT蛋白非常大（>300kDa），結構難於解析。即使可以解析，目前結構生物學的手段無法在細胞非變性條件下解析特定目標蛋白的精細結構，而體外純化的條件下則可能無法獲得蛋白折疊的各種構象，更加無法進一步證明各種構象可能的功能（毒性）差異。
用“蛋白質降解”來探尋答案2017年9月4日，Nature Chemical Biology線上發表了一篇論文[8]，由復旦大學魯伯塤課題組完成，該論文從一個嶄新的角度研究上述問題：蛋白質降解。
細胞中，新蛋白質在不斷地合成，完成功能的或者“錯誤折疊”的蛋白質則被不斷地降解，生成小的肽段或氨基酸。主要有兩個可能的因素影響蛋白降解速率：蛋白構象和蛋白功能。
一方面，蛋白構象很可能影響其降解速率，如果同類細胞的同一蛋白有著不同的降解速率，意味著該蛋白存在不同的構象；另一方面，蛋白降解是蛋白功能的終極調控。已有資料表明，疾病蛋白的降解速率與其神經毒性呈非常顯著的負相關，即致病蛋白降解越慢，其毒性越大[9]。因此，瞭解蛋白本身是否具有構象的“多態性”，以及不同構象蛋白的毒性是否具有“多態性”，都可以從研究蛋白的降解速率入手。如果不同polyQ抗體識別的HTT蛋白的降解速率不同，則證明的確存在不同構象，而且降解速率較慢的構象的毒性可能較大。
為了檢測以上假說，魯伯塤課題組測得了同一組樣品中被不同polyQ抗體（主要有MW1和3B5H10兩種）所識別的HTT蛋白的降解速率。他們所使用的測量方法被稱為CH-chase，是基於點擊化學（Click Chemistry）和均相時間分辨螢光（HTRF）技術而建立的。
首先，他們選用的細胞模型是病人的真皮成纖維細胞，這是因為該細胞中有全長的變異HTT蛋白，並且檢測不到寡聚體或多聚體，排除了可能的干擾因素，進而只檢測可溶性HTT蛋白單體的降解。研究顯示，在三種不同的病人真皮成纖維細胞中，polyQ抗體3B5H10所識別的HTT的降解速率顯著低於另一種polyQ抗體（MW1）所識別的HTT的降解速率，從而直接證明了不同polyQ構象的存在。這種降解速率差異在過表達的體系中一樣可以被檢測到。有趣的是，這種差異只在過長的polyQ（46Q，72Q，100Q）中存在，在野生型長度的polyQ（18Q及23Q）中並沒有檢測到，從而證明了過長的polyQ出現了“浮現構象”，因此產生了“多態性”。
那麼，是什麼因素減慢了這類HTT蛋白的降解速率呢？魯伯塤課題組的進一步研究發現，導致3B5H10抗體所識別的HTT蛋白的降解顯著變慢的原因，是因為其能夠抵抗自噬作用。
自噬（Autophagy）是細胞清除蛋白的重要手段，自噬小泡包裹住蛋白，並將其運送至溶酶體完成降解。自噬分子機制的發現獲得了2016年的諾貝爾獎。傳統觀點認為，自噬作用是非選擇性地，能隨機清除任何蛋白。然而近年研究發現，有些自噬過程中，自噬小泡會利用自噬受體蛋白p62或NBR1等有選擇性地吞噬特定的蛋白，這個過程稱為選擇性自噬。
魯伯塤課題組的研究發現，在病人細胞、小鼠大腦組織乃至病人大腦組織中，變異HTT蛋白的賴氨酸63型泛素化幾乎缺失，因此無法被選擇性自噬受體蛋白p62所識別，也就無法被選擇性自噬降解。這就解釋了為何這種HTT構象降解速度顯著變慢（圖2）。
圖2 亨廷頓致病蛋白HTT的polyQ長鏈有多種構象，其中具有毒性的構象蛋白比野生型蛋白降解得要慢，因為它無法被自噬小泡包裹而進行快速降解，這也可能是其產生更高神經毒性的原因。
這項最新研究揭示了導致亨廷頓疾病的變異蛋白HTT的polyQ長鏈存在多種不同的構象，並因此導致了不同的降解速率，產生了不同的毒性。這種“多態性”可能補充了對“Anfinsen法則”的認識。同時，該研究進一步明確了選擇性自噬作用的機制，發現選擇性自噬比之前認為的要更具選擇性：它不僅能識別特定的蛋白進行降解，甚至能識別同一蛋白的不同構象。
該研究在疾病研究領域也有重要意義，不僅刷新了科學家對疾病機制的認識，而且提供了治療疾病的新思路。例如，可尋找化合物迫使疾病蛋白從慢速降解的構象轉變為快速降解的構象，達到治療疾病的目的。不過，仍然有幾個關鍵問題亟待解答，比如，為何polyQ構象的改變會影響HTT的泛素化以及選擇性自噬的識別，其他polyQ蛋白是否具有類似的性質等，值得後續研究。
參考文獻
1.Walker, F.O., Huntington's disease. Lancet, 2007. 369(9557): p. 218-28.
2.Nasir, J., et al., Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell, 1995. 81(5): p. 811-23.
3.Li, P., et al., The structure of a polyQ-anti-polyQ complex reveals binding according to a linear lattice model. Nat Struct Mol Biol, 2007. 14(5): p. 381-7.
4.Klein, F.A., et al., Linear and extended: a common polyglutamine conformation recognized by the three antibodies MW1, 1C2 and 3B5H10. Hum Mol Genet, 2013. 22(20): p. 4215-23.
5.Zheng, S., et al., Deletion of the huntingtin polyglutamine stretch enhances neuronal autophagy and longevity in mice. PLoS Genet, 2010. 6(2): p. e1000838.
6.Miller, J., et al., Identifying polyglutamine protein species in situ that best predict neurodegeneration. Nat Chem Biol, 2011. 7(12): p. 925-34.
7.Owens, G.E., et al., Anti-PolyQ Antibodies Recognize a Short PolyQ Stretch in Both Normal and Mutant Huntingtin Exon 1. J Mol Biol, 2015. 427(15): p. 2507-19.
8.Fu, Y.W., P. Pan, Y. Sun, X, Yang, H. Difiglia, M. Lu, B., A toxic mutant huntingtin species is resistant to selective autophagy. Nature Chemical Biology, 2017.
9.Tsvetkov, A.S., et al., Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nat Chem Biol, 2013. 9(9): p. 586-92.
製版編輯： 許逸｜
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