Immunity：發現一群新的肝巨噬細胞
作者：荷葉
說起肝內定居型巨噬細胞，我們就想到了Kupffer細胞，
悉尼大學皇家愛爾弗雷德王子醫院的Sierro等發現了一群定居在肝包膜下的巨噬細胞（LCM），不同於Kupffer細胞來源於胚胎卵黃囊，LCM來源於血單核細胞。文章發表於2017年8月《Immunity》上（回復171012可下載，一周有效），今天荷葉和大家分享此篇論文。
文章解析
鑒定一群新的細胞可以從以下幾個方面著手：1）細胞群的特徵，2）起源，3）功能。荷葉從這幾方面分析該文章。
第一步，細胞群的特徵
細胞群的特徵可以分兩個方面，①細胞表面有什麼特異的標誌，②細胞的表達譜是否特異。
作者利用了多光子體內成像（2PM）對體內活細胞進行表面標誌的染色，發現肝包膜處的巨噬細胞與Kupffer相比，其偽足（樹突）更多更長。與Kupffer一樣，CD45+MHCII+F4/80+，但是特異的是：Tim4-CX3CR1+。
為了避免螢光抗體對巨噬細胞的啟動，作者採用了多種螢光報告小鼠，結果顯示，與Kupffer細胞相比肝包膜處的巨噬細胞特異的表達CD207（Langerin）。
FACS染色進一步確認了體內細胞染色的結果。
同時，肝臟切片螢光染色結果顯示CD207是肝包膜下巨噬細胞較特異的標誌。
白色虛線為肝包膜
進一步，作者採用目前最先進的細胞分群儀器——質譜流式分析儀，對肝內髓系細胞進行精確分群。結果發現肝包膜巨噬細胞LCM呈CD207+(GFP+)，同時表達CD64+F4/80+Tim4-CX3CR1+（Kupffer細胞Tim4+CX3CR1-）。
以上是通過表面標誌對肝包膜下細胞進行分群，那麼這群細胞確實是一群獨立的肝巨噬細胞嗎？為了回答這個問題，
這樣我們就能得到肝包膜下巨噬細胞LCM的基本特徵，
第二步，LCM來源於什麼細胞？
作者首先進行了骨髓移植實驗和肝移植實驗，發現骨髓細胞能夠補充肝臟的LCM。
其次，作者進行了小鼠的聯體實驗，進一步確認LCM來源於骨髓細胞。同時作者還發現CCR2缺陷骨髓細胞不能補充、更新LCM。
那麼是骨髓中的哪群細胞補充LCM呢？通過單核細胞/腹腔巨噬細胞移植實驗，發現血中單核細胞能分化成LCM。當以抗生素處理小鼠降低血中單核細胞數目時，LCM的數目同時降低。
深入研究發現，LCM的補充更新依賴CSF-1/CSF-1R信號。肝包膜區域高表達CSF-1，以抗體封閉CSF-1或CSF-1R能顯著降低小鼠LCM的數目。
通過上述結果我們得到結論：LCM來源於血單核細胞，並且依賴於CSF-1/CSF-1R信號。
第三步，LCM的功能是什麼？
研究發現LCM與肝包膜膠原纖維相鄰，具有長的突起（偽足），其一端伸出肝包膜，一端深入肝血竇，並且LCM偽足在不停的運動。
LCM的這種形態結構提示其可能具有感應周圍環境的作用，特別是肝包膜外環境。通過腹腔注射BCG模擬腹腔感染，發現LCM能向BCG延伸。同時LCM募集大量的中性粒細胞（Neu），Neu吞噬進入肝臟的BCG。
當以抗CSF-1R抗體降低LCM的數量時，在存在腹腔感染時Neu向肝包膜的募集顯著減少，提示Neu的募集確實依賴於LCM（分泌的某些趨化因數或細胞因數等）。
綜上所述，本篇文章鑒定了肝內的一群不同於Kupffer細胞的巨噬細胞——肝包膜下巨噬細胞LCM，它們就像邊疆的邊防戰士一樣守衛肝臟的周邊環境，當來自於腹腔微生物侵襲肝包膜時，LCM及時發出信號，招募大量Neu吞噬、消滅微生物，維持肝臟微環境的穩態。
荷葉點評
1、文章的矛盾之處：
1）Itgax又稱為CD11c，那麼為什麼在體內細胞成像和FACS檢測時肝實質巨噬細胞不表達CD11c，LCM低表達CD11c，而在Itgax-YFP小鼠中肝巨噬細胞和LCM又是YFP強陽性呢（紅圈圈出），是螢光強度的問題嗎？用Itgax-YFP做骨髓移植、肝移植實驗是否合適？
2）聯體實驗時發現CCR2敲除小鼠骨髓細胞不能補充更新LCM，但是作者又發現CCR2敲除小鼠LCM數目與對照相比無差異（紅圈圈出），前後是否有矛盾？
2、研究LCM起源比較權威的方法還有系譜示蹤，如果加上這個就更有說服力。
3、LCM分泌的什麼細胞因數募集Neu？荷葉認為可以補充相關實驗。
4、文章主要研究靜息狀態下和一些細菌感染時LCM的變化，下步可以深入研究其他疾病狀態下LCM的變化，比如腫瘤腹腔轉移或肝硬化時LCM會如何呢？
5、荷葉讀過不少細胞免疫方面的文章，感覺這類文章常常需要用到很多品系的小鼠，如本文用到了17種轉基因或基因敲除小鼠。此外本文還用到了先進的質譜流式分析儀（金屬標記抗體，可以有上百個通道）、多光子成像（體內活細胞標記），這些都不是一般實驗室能完成的，所以荷葉覺得很多時候實驗平臺很重要！
參考文獻：
Sierro F, Evrard M, Rizzetto S, Melino M, Mitchell AJ, Florido M, Beattie L, Walters SB, Tay SS, Lu B, Holz LE, Roediger B, Wong YC, Warren A, Ritchie W, McGuffog C, Weninger W, Le Couteur DG, Ginhoux F, Britton WJ, Heath WR, Saunders BM, McCaughan GW, Luciani F, MacDonald KPA, Ng LG, Bowen DG, Bertolino P.A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.Immunity. 2017 Aug 15;47(2):374-388.e6. doi: 10.1016/j.immuni.2017.07.018.
歡迎投稿
tougao@helixlife.com.cn
合作微信：helixlife6
其次，作者進行了小鼠的聯體實驗，進一步確認LCM來源於骨髓細胞。同時作者還發現CCR2缺陷骨髓細胞不能補充、更新LCM。
那麼是骨髓中的哪群細胞補充LCM呢？通過單核細胞/腹腔巨噬細胞移植實驗，發現血中單核細胞能分化成LCM。當以抗生素處理小鼠降低血中單核細胞數目時，LCM的數目同時降低。
深入研究發現，LCM的補充更新依賴CSF-1/CSF-1R信號。肝包膜區域高表達CSF-1，以抗體封閉CSF-1或CSF-1R能顯著降低小鼠LCM的數目。
通過上述結果我們得到結論：LCM來源於血單核細胞，並且依賴於CSF-1/CSF-1R信號。
第三步，LCM的功能是什麼？
研究發現LCM與肝包膜膠原纖維相鄰，具有長的突起（偽足），其一端伸出肝包膜，一端深入肝血竇，並且LCM偽足在不停的運動。
LCM的這種形態結構提示其可能具有感應周圍環境的作用，特別是肝包膜外環境。通過腹腔注射BCG模擬腹腔感染，發現LCM能向BCG延伸。同時LCM募集大量的中性粒細胞（Neu），Neu吞噬進入肝臟的BCG。
當以抗CSF-1R抗體降低LCM的數量時，在存在腹腔感染時Neu向肝包膜的募集顯著減少，提示Neu的募集確實依賴於LCM（分泌的某些趨化因數或細胞因數等）。
綜上所述，本篇文章鑒定了肝內的一群不同於Kupffer細胞的巨噬細胞——肝包膜下巨噬細胞LCM，它們就像邊疆的邊防戰士一樣守衛肝臟的周邊環境，當來自於腹腔微生物侵襲肝包膜時，LCM及時發出信號，招募大量Neu吞噬、消滅微生物，維持肝臟微環境的穩態。
荷葉點評
1、文章的矛盾之處：
1）Itgax又稱為CD11c，那麼為什麼在體內細胞成像和FACS檢測時肝實質巨噬細胞不表達CD11c，LCM低表達CD11c，而在Itgax-YFP小鼠中肝巨噬細胞和LCM又是YFP強陽性呢（紅圈圈出），是螢光強度的問題嗎？用Itgax-YFP做骨髓移植、肝移植實驗是否合適？
2）聯體實驗時發現CCR2敲除小鼠骨髓細胞不能補充更新LCM，但是作者又發現CCR2敲除小鼠LCM數目與對照相比無差異（紅圈圈出），前後是否有矛盾？
2、研究LCM起源比較權威的方法還有系譜示蹤，如果加上這個就更有說服力。
3、LCM分泌的什麼細胞因數募集Neu？荷葉認為可以補充相關實驗。
4、文章主要研究靜息狀態下和一些細菌感染時LCM的變化，下步可以深入研究其他疾病狀態下LCM的變化，比如腫瘤腹腔轉移或肝硬化時LCM會如何呢？
5、荷葉讀過不少細胞免疫方面的文章，感覺這類文章常常需要用到很多品系的小鼠，如本文用到了17種轉基因或基因敲除小鼠。此外本文還用到了先進的質譜流式分析儀（金屬標記抗體，可以有上百個通道）、多光子成像（體內活細胞標記），這些都不是一般實驗室能完成的，所以荷葉覺得很多時候實驗平臺很重要！
參考文獻：
Sierro F, Evrard M, Rizzetto S, Melino M, Mitchell AJ, Florido M, Beattie L, Walters SB, Tay SS, Lu B, Holz LE, Roediger B, Wong YC, Warren A, Ritchie W, McGuffog C, Weninger W, Le Couteur DG, Ginhoux F, Britton WJ, Heath WR, Saunders BM, McCaughan GW, Luciani F, MacDonald KPA, Ng LG, Bowen DG, Bertolino P.A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.Immunity. 2017 Aug 15;47(2):374-388.e6. doi: 10.1016/j.immuni.2017.07.018.
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