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人體低溫保存作為一種可能實現“復活”的新技術， 受到了越來越多的關注。
本文轉自公眾號“科學雜誌1915”
作者：竇蒙家 張明寬 等
古代能夠輕易奪走生命的傷寒， 現在只需要幾粒藥丸便能治癒， 醫學的發展使得許多“不治之症”成為過去， 但是如何才能讓已經處於生命邊緣的人吃到“未來之藥”呢？人們求助於人體低溫保存技術。 2017年5月， 因患肺癌離世的展文蓮在山東齊魯醫院和銀豐生命科學研究院的共同協助下完成了中國第一例人體低溫保存， 期望將來通過一定的科技手段“復活”， 重新獲得健康。
何謂人體低溫保存
低溫生物學是一門研究低溫條件下（0℃以下或者接近0℃）生命現象以及生物體保存的科學。 1949年， 英國生物學家波爾熱（C. Polge）和史密斯（A. U. Smith）偶然發現精子在甘油溶液中可以經歷低溫冷凍而不死亡，
隨著科學技術的發展，
人體低溫保存方案
不同冷凍速度下的細胞低溫保存[4]
根據美國Alcor生命延續基金會的人體低溫保存方案 [3]， 理想情況下， 在人體心臟停止跳動後， 等候的工作人員迅速利用生命支援技術來維持其腦活力。 這些生命支援技術包括在將人體置於冰水浴中（低溫抑制新陳代謝）的同時，人工恢復其血液迴圈和呼吸，為大腦提供氧合血的同時增強冷卻；通過靜脈注射施用包括自由基抑制劑、抗凝血藥、升壓藥等保護性藥物以保持血壓，改善迴圈，抑制血液凝固並保護大腦。當體溫降低到接近水的冰點時，進行冷凍保護劑灌注。在此之前，為清洗血液，在0℃以下將一種基礎灌注液注入人體血液循環系統中，迴圈數分鐘。為使滲透壓最小，以及提供足夠的時間使冷凍保護劑滲透到細胞內，在接下來的兩個小時內，將冷凍保護劑的濃度以線性速率增加到目標濃度的一半，並注入血液循環系統中。最後，在1個小時內，迅速把冷凍保護劑的濃度增加到目標濃度。灌注冷凍保護劑後，系統在電腦控制下，將人體在3個小時內冷卻至－124℃，以避免冰晶的形成。在接下來的兩周內，人體被進一步冷卻到－196℃，並被轉移到液氮中進行長期保存。
人體低溫保存的技術瓶頸
生物體雖然能在低溫下長期保存，但是在冷凍和複溫過程中非常容易受到損傷，而這個損傷基本上發生在－60℃~0℃這段溫度範圍內。根據低溫物理學家梅熱（P. Mazur）等人提出的“兩因素假說”，常溫下，細胞內液和細胞外液處於等溫和等滲的狀態，但在冷凍和複溫過程中，由於傳熱和傳質速率的不同，會造成細胞冰晶形成的大小、形狀、位置等的不同，從而對細胞造成“溶質損傷”或“胞內冰損傷”。冰晶會刺穿、擠壓細胞膜、細胞器等，並且胞內冰的形成使細胞內電解質濃度升高，pH變化，進而引起部分蛋白質的變性以及溶酶體的損傷，最終導致細胞死亡。所以，在不同的生物體低溫保存過程中，需要獲得其“最佳冷凍速率”。該速率既可以防止胞內冰形成，又能將“溶質損傷”降到最小，以提高細胞低溫保存後的恢復率。
為減少0℃以下冰的形成對生物體的機械損傷，冷凍保護劑常被配製成一定濃度的溶液。甘油是人類最早發現的冷凍保護劑，在早期的冷凍方案中常見到。但是由於其滲透速率慢，冷凍效果不理想，已逐漸被取代。二甲基亞碸（DMSO）是第一種用於人類胚胎保存的冷凍保護劑，其滲透速率快，可以快速穿透細胞膜進入細胞內，降低冰點，延緩凍存過程，同時提高細胞內離子濃度，減少胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷。深低溫時DMSO的細胞毒性受到抑制，但是當高於4℃時，長時間暴露於DMSO中會對細胞造成損傷且DMSO會誘導幹細胞分化 [5]。目前研究者正致力於發展慢速冷凍—快速解凍方案中可以替代DMSO的冷凍保護劑。比如，海藻糖對生物抗脫水、抗冷凍、抗高滲有積極作用，對生物膜、蛋白質和核酸等生物大分子也發揮著保護的功效；脯氨酸不僅能夠穩定生物大分子結構，降低細胞酸性，調節細胞氧化還原電位匯，而且作為細胞的滲透型冷凍保護劑，能夠降低冰點，防止細胞脫水[6]。所以，尋找生物友好型冷凍保護劑及合適的冷凍保護劑組合對於生物體的成功低溫保存及復蘇是極其關鍵的。
冷凍方法主要分為標準程式化冷凍和玻璃化冷凍。近些年，玻璃化冷凍由於在保存過程中不產生冰晶，受到了越來越多的關注。它是一種利用高濃度冷凍保護劑溶液的超速凍存生物體的方法，實施冷凍保存過程中快速降溫及升溫，才有可能實現成功的玻璃化冷凍。目前該技術在細胞尺度上可以較為成功地實施。但是當生物體體積增大時，實施起來就會有較大困難。由佩內斯生物傳熱方程（Pennes bio-hent equation）可知，當血液灌注率及人體代謝產熱停滯時，熱流密度正比於熱導率和溫度差。由於人體組織導熱率較小，若使大量冷量快速傳輸到人體，就一定會產生較大的溫度差，最終造成生物體內部溫度梯度增大，進而引起冰核的形成和生長。此外，複溫時，在大體積的生物體中極易引起重結晶。塞基（S. Seki）研究表明，對於實行玻璃化冷凍的生物材料，在複溫過程減少再結晶的方法之一便是提高複溫速率，減少冷凍保護劑在重結晶危險溫度區域停留的時間，使冷凍保護劑從玻璃化狀態直接轉化為液態。但是，同樣由於人體體積與熱導率的特點，這一點實現起來困難重重。可見，在冷凍與複溫過程中所遭受的雙重破壞下，組織、器官及人體的低溫保存是極其困難的。
相對於細胞、組織、器官來說，人體的生命結構更加複雜。尤其像人腦這樣複雜的結構，有1000億個神經元及1萬個神經連接，冷凍保存時極易受到損傷，低溫保存後的大腦所擁有的記憶是否能夠保存也未可知。
低溫保存發展現狀
卵巢組織玻璃化冷凍前後比較 (a)玻璃化冷凍前；(b)玻璃化冷凍後[8]。
組織玻璃化凍存後對流傳熱加熱和納米加熱[9](a)獲取人體組織；(b)將人體組織在液氮下進行冷凍保存；(c)和(e)取出冷凍組織，準備複溫；(d)採用傳統的對流傳熱方法進行複溫；(f)在冷凍保護劑中加入氧化鐵納米顆粒進行複溫。
人體結構由微觀到宏觀可以分為細胞、組織、器官、系統與人體五個層次，低溫保存的終極目標是實現人體長期的低溫保存並復蘇。就目前的科技水準而言，實現這一目標任重而道遠，但低溫保存領域仍有著廣泛的應用。
細胞低溫保存已經在醫學中發揮著重要作用。例如，人類卵母細胞冷凍作為生育力保存的途徑之一，已經在輔助生殖技術中扮演著不可或缺的角色。而卵母細胞的冷凍技術，特別是冷凍方式和冷凍保護劑，經過多年的發展取得了較大的進步。越來越多的實驗研究表明，玻璃化冷凍具有更好的冷凍保存效果，格盧約夫斯基（D. Glujovsky） 等人在2014年的研究中，對106名患者進行了隨機對照試驗，結果顯示玻璃化冷凍與慢速冷凍相比具有更高的妊娠率 [7]。
構成人體的細胞有200多種，各種細胞間都存在著較大的差異，如每種細胞的體積不同，組織滲透率和導熱性能也不同，因此，最佳的冷凍速率和冷凍保護劑也因細胞種類的不同而不同。由多種不同細胞構成的組織具有更加複雜的結構和更大的體積，這無疑增加了組織在冷凍過程中熱量傳遞和保護劑傳遞的難度，因此組織低溫保存相較於細胞低溫保存而言，效果較差，難度更大。不過，隨著近幾十年低溫生物傳熱研究的迅速發展，組織低溫保存在醫學領域也已能施展一定的“拳腳”。以生殖醫學為例，早在2004年，多內（J. Donnez）等人就利用慢速冷凍法保存了一名淋巴癌患者的卵巢組織，並且在解凍後實現了自體盆腔移植，最後使患者成功分娩一名女嬰。根據西爾伯（S. Silber） 提供的資料顯示，到2016年為止，全球有70多個嬰兒依靠卵巢移植技術降生，其中西爾伯小組共進行了13例卵巢冷凍移植手術，最終順利產下9名嬰兒，成活率超過70%[8]。
不過，低溫保存的“威力”也僅限於此。對於離體器官而言，目前只能實現短期保存，以臨床保存經驗最多的腎臟為例，用機器持續低溫灌洗法僅僅可以安全保存3天。如前所述，樣本體積較大時，冷凍與複溫過程中熱量難以均勻導入，最終導致冷凍與複溫的結果並不理想。2017年，比斯科夫（J. C. Bischof）研究團隊在冷凍保護劑中加入介孔二氧化矽包被的氧化鐵納米顆粒，通過射頻激發加熱，使整個樣品受熱更加快速均勻，成功實現了玻璃化冷凍的最高80毫升物理系統及50 毫升生物系統的復蘇。比斯科夫表示，該技術克服了移植醫學中的一個重大障礙，或使器官低溫保存成為現實，其應用前景非常樂觀。目前，動物器官相關實驗已在進行中，很有可能在未來7~10年內開始人類器官低溫保存實驗 [9]。儘管從理論上講，該技術可以實現整個冷凍器官快速複溫，但是還有很多問題需要進一步的實驗研究。
經過幾百萬年的進化，許多生物體已經具有忍受機體凍結的能力。例如，阿拉斯加木蛙（Rana sylvatica）已被證實可以在低至－16℃的溫度下凍結，並在－4℃下忍受2個月的凍結期 [10]。當面對寒冷刺激時，南極線蟲（Panagrolaimus davidi）能產生穩定細胞膜的海藻糖及抑制重結晶的蛋白質，最高可以耐受高達82％體液的凍結[11]。這些現象拓寬了研究人員的思路，即通過研究自然界中能忍受凍結的生物體所採用的生物學機制，尋找更好的冷凍保護劑及低溫保存方法。早在十多年前，就有科學家提出，將冷凍保護劑進行活體載入，人為地使冷凍保護劑參與生物體的生命活動，之後再對其實施低溫凍存[12]。研究人員在研究抗凍生物體合成的抗凍蛋白等生物友好型冷凍保護劑的冷凍保護機制中，從生物體（尤其是抗凍魚類、昆蟲等）中分離提純抗凍蛋白，用於低溫保存領域，取得了較為理想的效果。在2012年的一項研究中，科研人員用富含脯氨酸的食物餵養對寒冷敏感的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲，使其組織中積聚脯氨酸，再將這些果蠅進行低溫保存實驗。結果顯示，果蠅在－5℃時，能夠忍受大約50％的體液冷凍，並且復蘇後其生命活動也沒有受到影響[13]。
可以預見的是，借鑒動物天然的耐寒機理，效法自然，發展仿生型低溫保存技術，將成為今後突破人體低溫保存技術瓶頸的最有前景的方向之一。
總之，人體低溫保存技術目前並不十分成熟，儘管有越來越多的人體被低溫保存，但是各大保存機構也承認無法兌現復活時間，要成功實現復活不僅要面對宗教、法律、倫理方面的挑戰，更受到諸多科學技術的限制。目前不僅需要解決冷凍及複溫過程中造成的細胞損傷、冷凍保護劑毒性等難題，還需探索合適的冷凍和複溫過程，解決復蘇後的生物學問題（如大腦記憶的恢復），一步步地從離體細胞、組織、器官、小動物、大動物的低溫保存開展深入嚴謹的研究，這將是一條漫長的科學探索之路。
竇蒙家，碩士研究生；張明寬，碩士研究生；饒偉，研究員；劉靜，研究員：中國科學院理化技術研究所低溫工程學重點實驗室，北京市低溫生物醫學工程學重點實驗室，北京100190。
Dou Mengjia, Master; Zhang Mingkuan, Master; Rao Wei, Research Professor; Liu Jing, Research Professor: Beijing Key Lab of CryoBiomedical Engineering and Key Lab of Cryogenics, Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190.
Foundation Alcor Life Extension. Alcor Membership Statistics. 2017.
Insititute Cryonics. Cryonics Institute Member Statistics Details. 2017.
Foundation Alcor Life Extension. Alcor Life Extension Foundation Human Cryopreservation Protocol. 2016.
Martín-Ibáñez Raquel, Hovatta Outi, Canals Josep M. Cryopreservation of Human Pluripotent Stem Cells: Are We Going in the Right Direction?. InTech, 2012.
Rao Wei, Huang Haishui, Wang Hai, et al. Nanoparticle-Mediated Intracellular Delivery Enables Cryopreservation of Human Adipose-Derived Stem Cells Using Trehalose as the Sole Cryoprotectant. Acs Applied Materials & Interfaces, 2015, 7(8): 5017.
Zhang Lu, Xue Xu, Yan Jie, et al. L-proline: a highly effective cryoprotectant for mouse oocyte vitrification. Scientific Reports, 2016, 6:26326.
Glujovsky Demián, Riestra Barbara, Sueldo Carlos, et al. Vitrification versus slow freezing for women undergoing oocyte cryopreservation. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2014, 9(9): CD010047.
Silber Sherman. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation: scientific implications. Journal of Assisted Reproduction & Genetics, 2016, 33(12): 1-9.
Manuchehrabadi Navid, Gao Zhe, Zhang Jinjin, et al. Improved tissue cryopreservation using inductive heating of magnetic nanoparticles. Science Translational Medicine, 2017, 9(379): eaah4586.
Costanzo Jon P, Reynolds Alice M, Amaral M, et al. Cryoprotectants and extreme freeze tolerance in a subarctic population of the wood frog. Plos One, 2015, 10(2): e0117234.
Raymond Mélianie R, Wharton David A. The ability of the Antarctic nematode Panagrolaimus davidi to survive intracellular freezing is dependent upon nutritional status. Journal of Comparative Physiology B, 2013, 183(2): 181-188.
于麗娜, 劉靜. 突破生物材料低溫保存技術瓶頸的仿生學途徑評價. 科技導報, 2005, 23(11): 69-72.
Koštál Vladimír, Šimek Petr, Zahradníčková Helena, et al. Conversion of the chill susceptible fruit fly larva (Drosophila melanogaster) to a freeze tolerant organism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(9): 3270-3274.
這些生命支援技術包括在將人體置於冰水浴中（低溫抑制新陳代謝）的同時，人工恢復其血液迴圈和呼吸，為大腦提供氧合血的同時增強冷卻；通過靜脈注射施用包括自由基抑制劑、抗凝血藥、升壓藥等保護性藥物以保持血壓，改善迴圈，抑制血液凝固並保護大腦。當體溫降低到接近水的冰點時，進行冷凍保護劑灌注。在此之前，為清洗血液，在0℃以下將一種基礎灌注液注入人體血液循環系統中，迴圈數分鐘。為使滲透壓最小，以及提供足夠的時間使冷凍保護劑滲透到細胞內，在接下來的兩個小時內，將冷凍保護劑的濃度以線性速率增加到目標濃度的一半，並注入血液循環系統中。最後，在1個小時內，迅速把冷凍保護劑的濃度增加到目標濃度。灌注冷凍保護劑後，系統在電腦控制下，將人體在3個小時內冷卻至－124℃，以避免冰晶的形成。在接下來的兩周內，人體被進一步冷卻到－196℃，並被轉移到液氮中進行長期保存。人體低溫保存的技術瓶頸
生物體雖然能在低溫下長期保存，但是在冷凍和複溫過程中非常容易受到損傷，而這個損傷基本上發生在－60℃~0℃這段溫度範圍內。根據低溫物理學家梅熱（P. Mazur）等人提出的“兩因素假說”，常溫下，細胞內液和細胞外液處於等溫和等滲的狀態，但在冷凍和複溫過程中，由於傳熱和傳質速率的不同，會造成細胞冰晶形成的大小、形狀、位置等的不同，從而對細胞造成“溶質損傷”或“胞內冰損傷”。冰晶會刺穿、擠壓細胞膜、細胞器等，並且胞內冰的形成使細胞內電解質濃度升高，pH變化，進而引起部分蛋白質的變性以及溶酶體的損傷，最終導致細胞死亡。所以，在不同的生物體低溫保存過程中，需要獲得其“最佳冷凍速率”。該速率既可以防止胞內冰形成，又能將“溶質損傷”降到最小，以提高細胞低溫保存後的恢復率。
為減少0℃以下冰的形成對生物體的機械損傷，冷凍保護劑常被配製成一定濃度的溶液。甘油是人類最早發現的冷凍保護劑，在早期的冷凍方案中常見到。但是由於其滲透速率慢，冷凍效果不理想，已逐漸被取代。二甲基亞碸（DMSO）是第一種用於人類胚胎保存的冷凍保護劑，其滲透速率快，可以快速穿透細胞膜進入細胞內，降低冰點，延緩凍存過程，同時提高細胞內離子濃度，減少胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷。深低溫時DMSO的細胞毒性受到抑制，但是當高於4℃時，長時間暴露於DMSO中會對細胞造成損傷且DMSO會誘導幹細胞分化 [5]。目前研究者正致力於發展慢速冷凍—快速解凍方案中可以替代DMSO的冷凍保護劑。比如，海藻糖對生物抗脫水、抗冷凍、抗高滲有積極作用，對生物膜、蛋白質和核酸等生物大分子也發揮著保護的功效；脯氨酸不僅能夠穩定生物大分子結構，降低細胞酸性，調節細胞氧化還原電位匯，而且作為細胞的滲透型冷凍保護劑，能夠降低冰點，防止細胞脫水[6]。所以，尋找生物友好型冷凍保護劑及合適的冷凍保護劑組合對於生物體的成功低溫保存及復蘇是極其關鍵的。
冷凍方法主要分為標準程式化冷凍和玻璃化冷凍。近些年，玻璃化冷凍由於在保存過程中不產生冰晶，受到了越來越多的關注。它是一種利用高濃度冷凍保護劑溶液的超速凍存生物體的方法，實施冷凍保存過程中快速降溫及升溫，才有可能實現成功的玻璃化冷凍。目前該技術在細胞尺度上可以較為成功地實施。但是當生物體體積增大時，實施起來就會有較大困難。由佩內斯生物傳熱方程（Pennes bio-hent equation）可知，當血液灌注率及人體代謝產熱停滯時，熱流密度正比於熱導率和溫度差。由於人體組織導熱率較小，若使大量冷量快速傳輸到人體，就一定會產生較大的溫度差，最終造成生物體內部溫度梯度增大，進而引起冰核的形成和生長。此外，複溫時，在大體積的生物體中極易引起重結晶。塞基（S. Seki）研究表明，對於實行玻璃化冷凍的生物材料，在複溫過程減少再結晶的方法之一便是提高複溫速率，減少冷凍保護劑在重結晶危險溫度區域停留的時間，使冷凍保護劑從玻璃化狀態直接轉化為液態。但是，同樣由於人體體積與熱導率的特點，這一點實現起來困難重重。可見，在冷凍與複溫過程中所遭受的雙重破壞下，組織、器官及人體的低溫保存是極其困難的。
相對於細胞、組織、器官來說，人體的生命結構更加複雜。尤其像人腦這樣複雜的結構，有1000億個神經元及1萬個神經連接，冷凍保存時極易受到損傷，低溫保存後的大腦所擁有的記憶是否能夠保存也未可知。
低溫保存發展現狀
卵巢組織玻璃化冷凍前後比較 (a)玻璃化冷凍前；(b)玻璃化冷凍後[8]。
組織玻璃化凍存後對流傳熱加熱和納米加熱[9](a)獲取人體組織；(b)將人體組織在液氮下進行冷凍保存；(c)和(e)取出冷凍組織，準備複溫；(d)採用傳統的對流傳熱方法進行複溫；(f)在冷凍保護劑中加入氧化鐵納米顆粒進行複溫。
人體結構由微觀到宏觀可以分為細胞、組織、器官、系統與人體五個層次，低溫保存的終極目標是實現人體長期的低溫保存並復蘇。就目前的科技水準而言，實現這一目標任重而道遠，但低溫保存領域仍有著廣泛的應用。
細胞低溫保存已經在醫學中發揮著重要作用。例如，人類卵母細胞冷凍作為生育力保存的途徑之一，已經在輔助生殖技術中扮演著不可或缺的角色。而卵母細胞的冷凍技術，特別是冷凍方式和冷凍保護劑，經過多年的發展取得了較大的進步。越來越多的實驗研究表明，玻璃化冷凍具有更好的冷凍保存效果，格盧約夫斯基（D. Glujovsky） 等人在2014年的研究中，對106名患者進行了隨機對照試驗，結果顯示玻璃化冷凍與慢速冷凍相比具有更高的妊娠率 [7]。
構成人體的細胞有200多種，各種細胞間都存在著較大的差異，如每種細胞的體積不同，組織滲透率和導熱性能也不同，因此，最佳的冷凍速率和冷凍保護劑也因細胞種類的不同而不同。由多種不同細胞構成的組織具有更加複雜的結構和更大的體積，這無疑增加了組織在冷凍過程中熱量傳遞和保護劑傳遞的難度，因此組織低溫保存相較於細胞低溫保存而言，效果較差，難度更大。不過，隨著近幾十年低溫生物傳熱研究的迅速發展，組織低溫保存在醫學領域也已能施展一定的“拳腳”。以生殖醫學為例，早在2004年，多內（J. Donnez）等人就利用慢速冷凍法保存了一名淋巴癌患者的卵巢組織，並且在解凍後實現了自體盆腔移植，最後使患者成功分娩一名女嬰。根據西爾伯（S. Silber） 提供的資料顯示，到2016年為止，全球有70多個嬰兒依靠卵巢移植技術降生，其中西爾伯小組共進行了13例卵巢冷凍移植手術，最終順利產下9名嬰兒，成活率超過70%[8]。
不過，低溫保存的“威力”也僅限於此。對於離體器官而言，目前只能實現短期保存，以臨床保存經驗最多的腎臟為例，用機器持續低溫灌洗法僅僅可以安全保存3天。如前所述，樣本體積較大時，冷凍與複溫過程中熱量難以均勻導入，最終導致冷凍與複溫的結果並不理想。2017年，比斯科夫（J. C. Bischof）研究團隊在冷凍保護劑中加入介孔二氧化矽包被的氧化鐵納米顆粒，通過射頻激發加熱，使整個樣品受熱更加快速均勻，成功實現了玻璃化冷凍的最高80毫升物理系統及50 毫升生物系統的復蘇。比斯科夫表示，該技術克服了移植醫學中的一個重大障礙，或使器官低溫保存成為現實，其應用前景非常樂觀。目前，動物器官相關實驗已在進行中，很有可能在未來7~10年內開始人類器官低溫保存實驗 [9]。儘管從理論上講，該技術可以實現整個冷凍器官快速複溫，但是還有很多問題需要進一步的實驗研究。
經過幾百萬年的進化，許多生物體已經具有忍受機體凍結的能力。例如，阿拉斯加木蛙（Rana sylvatica）已被證實可以在低至－16℃的溫度下凍結，並在－4℃下忍受2個月的凍結期 [10]。當面對寒冷刺激時，南極線蟲（Panagrolaimus davidi）能產生穩定細胞膜的海藻糖及抑制重結晶的蛋白質，最高可以耐受高達82％體液的凍結[11]。這些現象拓寬了研究人員的思路，即通過研究自然界中能忍受凍結的生物體所採用的生物學機制，尋找更好的冷凍保護劑及低溫保存方法。早在十多年前，就有科學家提出，將冷凍保護劑進行活體載入，人為地使冷凍保護劑參與生物體的生命活動，之後再對其實施低溫凍存[12]。研究人員在研究抗凍生物體合成的抗凍蛋白等生物友好型冷凍保護劑的冷凍保護機制中，從生物體（尤其是抗凍魚類、昆蟲等）中分離提純抗凍蛋白，用於低溫保存領域，取得了較為理想的效果。在2012年的一項研究中，科研人員用富含脯氨酸的食物餵養對寒冷敏感的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲，使其組織中積聚脯氨酸，再將這些果蠅進行低溫保存實驗。結果顯示，果蠅在－5℃時，能夠忍受大約50％的體液冷凍，並且復蘇後其生命活動也沒有受到影響[13]。
可以預見的是，借鑒動物天然的耐寒機理，效法自然，發展仿生型低溫保存技術，將成為今後突破人體低溫保存技術瓶頸的最有前景的方向之一。
總之，人體低溫保存技術目前並不十分成熟，儘管有越來越多的人體被低溫保存，但是各大保存機構也承認無法兌現復活時間，要成功實現復活不僅要面對宗教、法律、倫理方面的挑戰，更受到諸多科學技術的限制。目前不僅需要解決冷凍及複溫過程中造成的細胞損傷、冷凍保護劑毒性等難題，還需探索合適的冷凍和複溫過程，解決復蘇後的生物學問題（如大腦記憶的恢復），一步步地從離體細胞、組織、器官、小動物、大動物的低溫保存開展深入嚴謹的研究，這將是一條漫長的科學探索之路。
竇蒙家，碩士研究生；張明寬，碩士研究生；饒偉，研究員；劉靜，研究員：中國科學院理化技術研究所低溫工程學重點實驗室，北京市低溫生物醫學工程學重點實驗室，北京100190。
Dou Mengjia, Master; Zhang Mingkuan, Master; Rao Wei, Research Professor; Liu Jing, Research Professor: Beijing Key Lab of CryoBiomedical Engineering and Key Lab of Cryogenics, Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190.
Foundation Alcor Life Extension. Alcor Membership Statistics. 2017.
Insititute Cryonics. Cryonics Institute Member Statistics Details. 2017.
Foundation Alcor Life Extension. Alcor Life Extension Foundation Human Cryopreservation Protocol. 2016.
Martín-Ibáñez Raquel, Hovatta Outi, Canals Josep M. Cryopreservation of Human Pluripotent Stem Cells: Are We Going in the Right Direction?. InTech, 2012.
Rao Wei, Huang Haishui, Wang Hai, et al. Nanoparticle-Mediated Intracellular Delivery Enables Cryopreservation of Human Adipose-Derived Stem Cells Using Trehalose as the Sole Cryoprotectant. Acs Applied Materials & Interfaces, 2015, 7(8): 5017.
Zhang Lu, Xue Xu, Yan Jie, et al. L-proline: a highly effective cryoprotectant for mouse oocyte vitrification. Scientific Reports, 2016, 6:26326.
Glujovsky Demián, Riestra Barbara, Sueldo Carlos, et al. Vitrification versus slow freezing for women undergoing oocyte cryopreservation. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2014, 9(9): CD010047.
Silber Sherman. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation: scientific implications. Journal of Assisted Reproduction & Genetics, 2016, 33(12): 1-9.
Manuchehrabadi Navid, Gao Zhe, Zhang Jinjin, et al. Improved tissue cryopreservation using inductive heating of magnetic nanoparticles. Science Translational Medicine, 2017, 9(379): eaah4586.
Costanzo Jon P, Reynolds Alice M, Amaral M, et al. Cryoprotectants and extreme freeze tolerance in a subarctic population of the wood frog. Plos One, 2015, 10(2): e0117234.
Raymond Mélianie R, Wharton David A. The ability of the Antarctic nematode Panagrolaimus davidi to survive intracellular freezing is dependent upon nutritional status. Journal of Comparative Physiology B, 2013, 183(2): 181-188.
于麗娜, 劉靜. 突破生物材料低溫保存技術瓶頸的仿生學途徑評價. 科技導報, 2005, 23(11): 69-72.
Koštál Vladimír, Šimek Petr, Zahradníčková Helena, et al. Conversion of the chill susceptible fruit fly larva (Drosophila melanogaster) to a freeze tolerant organism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(9): 3270-3274.