施一與田克恭組發現偽狂犬病毒中和抗體

近日， 中國科學院微生物研究所病原微生物與免疫重點實驗室施一研究組與河南農業大學、國家獸用藥品工程技術研究中心田克恭教授合作， 在靶向偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）囊膜糖蛋白gB的中和抗體研究方面取得重要進展， 為偽狂犬病毒疫苗和抗體研發提供了重要理論基礎。

偽狂犬病病毒（PRV）是感染許多家畜的新興的獸醫病原體。 自2011年以來， 中國許多農場出現高致病性PRV變異， 給動物產業帶來了巨大的經濟負擔。 但目前市售疫苗無法對這些新出現的菌株提供有效保護。 包膜糖蛋白B（gB）是已知在PRV進入中起關鍵作用的主要病毒抗原。

為了控制PRV流行和治療相關疾病， 將結構和免疫學方法結合起來， 產生針對PRV gB的潛在中和抗體， 並研究其工作機制。 鑒定了總共15種單克隆抗體（mAb）， 具有良好的中和活性。 其中， 14株單克隆抗體靶向PRV gB的IV區， 通過補體效應阻斷病毒進入。 相反， 剩餘的1H1mAb識別PRV gB的結構域I， 其可以中和不依賴於補體的病毒進入， 並可能通過干擾膜融合過程。 工作揭示了PRV gB的結構細節和免疫原性， 並且可能為開發針對PRV感染的抗病毒治療劑和疫苗提供重要的指導。

PRV屬於皰疹病毒科水痘病毒屬， 是一種能感染多種家養及野生動物的病原體。 從2011年開始， 我國的多個豬養殖場相繼出現高致病性的PRV變異株感染疫情， 造成了巨大的經濟損失。 然而現有的疫苗只對傳統PRV毒株有效， 卻不能對新流行的突變株提供有效的保護， 因而開發新型的PRV疫苗和治療性藥物對於疫情控制至關重要。 gB是PRV表面一種重要的囊膜糖蛋白， 在病毒入侵細胞過程中起著關鍵作用。 同時， gB也是一種重要的病毒表面抗原，

能夠誘導機體產生中和抗體以對抗病毒感染， 因此， gB成為偽狂犬病毒疫苗和藥物設計的一個理想靶標。

用Bac-to-Bac表達系統表達了PRV gB的胞外結構域。 然後將純化的可溶性gB蛋白質用於免疫小鼠。 最初由間接ELISA從數百個雜交瘤細胞中選擇總共43個gB特異性mAb。 然後進行病毒進入抑制測定以評估這些mAb的中和活性。 通過添加或不添加外源兔補體來平行地進行測試以鑒定潛在的補體依賴性中和活性。 鑒定了總共15種中和性mAb， 其有效地阻斷了PRV進入豬腎細胞（PK-15）。 其中， 14種單克隆抗體僅在補體存在下阻斷病毒入侵， 表明它們通過補體效應發揮中和活性。 剩下的一個1H1mAb直接中和了病毒而不添加補體。 因此， 1H1 mAb可能通過干擾受體結合或膜融合過程來阻斷PRV的進入。

研究人員通過免疫學方法， 篩選獲得了15株針對gB的鼠源中和抗體，

作為唯一不依賴補體的中和抗體， 進一步分析了1H1單克隆抗體對八種不同PRV毒株， 包括疫苗毒株（Bartha和HB98）， 經典毒株（RA和SU）以及目前新出現的變種毒株（HN1201 ， 188-5,072-1和BH1）。 有趣的是， 1H1單克隆抗體顯示出廣譜的中和活性，

對所有測試的PRV毒株都有不同的功效。 它能有效地中和HN1201， BH1,188-5， RA和Bartha菌株， IC50值為15.2〜31.6μg/ mL。 相比之下， 阻斷SU， 072-1和HB98菌株的進入效果不佳， 其中IC50值從68.31至92.73μg/ mL變化。 由於1H1 mAb靶向PRV gB， 不同PRV毒株的gBs共用超過95％的序列同一性， 所以可以想像1H1 mAb中和了一大批PRV毒株。

並對其作用機制進行了深入研究。 根據抗體發揮中和作用的補體依賴性進行區分， 這15株抗體被劃分為兩個類群——其中有14株依賴於補體而發揮中和活性， 另外1株（1H1）則不依賴補體而直接阻斷病毒入侵。 並且， 1H1單克隆抗體具有廣譜中和活性， 能抑制傳統野生型和多種變異株PRV感染細胞。 為了探索這些抗體的中和機制， 研究人員通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、生物膜干涉技術（BLI）和電鏡三維重構技術， 揭示了上述兩類抗體的表位在gB表面的分佈。其中14株補體依賴性抗體的表位均分佈於gB的頭部區第四結構域，而1H1的表位則位於含有融合肽（fusion loop）的gB基部區第一結構域（圖1）。並且，1H1的表位被初步定位於以gB 基部區210螺旋為中心的區域，其中第214位元的精氨酸在gB和1H1相互作用中起著至關重要的作用（210-helix，圖2）。由於該表位與融合肽較為鄰近，提示1H1抗體的結合很可能會干擾病毒與細胞之間的膜融合過程從而發揮中和作用。綜上所述，該項研究證明了gB的頭部區和基部區含有多種抗原表位，而靶向不同表位的抗體通過不同的作用機制抑制病毒感染細胞，為抗病毒藥物的開發以及亞單位疫苗的研發提供了新的思路。

該項研究得到了國家重點研發計畫、科技部973項目、國家自然科學基金委優秀青年基金、中國科學院青年創新促進會以及河南省重大科技專案等的資助。該研究同時得到了中國科學院微生物研究所高福院士、四川大學逯光文教授等專家的支持。相關成果於2017年12月20日在國際知名微生物學期刊PLoS Pathogens上線上發表。該文章第一作者為國家獸用藥品工程技術研究中心李向東博士，河南農業大學教授、國家獸用藥品工程技術研究中心主任田克恭及中國科學院微生物研究所研究員施一為論文共同通訊作者。

揭示了上述兩類抗體的表位在gB表面的分佈。其中14株補體依賴性抗體的表位均分佈於gB的頭部區第四結構域，而1H1的表位則位於含有融合肽（fusion loop）的gB基部區第一結構域（圖1）。並且，1H1的表位被初步定位於以gB 基部區210螺旋為中心的區域，其中第214位元的精氨酸在gB和1H1相互作用中起著至關重要的作用（210-helix，圖2）。由於該表位與融合肽較為鄰近，提示1H1抗體的結合很可能會干擾病毒與細胞之間的膜融合過程從而發揮中和作用。綜上所述，該項研究證明了gB的頭部區和基部區含有多種抗原表位，而靶向不同表位的抗體通過不同的作用機制抑制病毒感染細胞，為抗病毒藥物的開發以及亞單位疫苗的研發提供了新的思路。

該項研究得到了國家重點研發計畫、科技部973項目、國家自然科學基金委優秀青年基金、中國科學院青年創新促進會以及河南省重大科技專案等的資助。該研究同時得到了中國科學院微生物研究所高福院士、四川大學逯光文教授等專家的支持。相關成果於2017年12月20日在國際知名微生物學期刊PLoS Pathogens上線上發表。該文章第一作者為國家獸用藥品工程技術研究中心李向東博士，河南農業大學教授、國家獸用藥品工程技術研究中心主任田克恭及中國科學院微生物研究所研究員施一為論文共同通訊作者。