1997年2月， 英國Roslin研究所伊恩 維爾穆特(Ian Wilmut)教授率領的團隊在頂級學術期刊《自然》(Science)公佈了“多莉”羊的誕生。 這只實際上出生於1996年5月的首例體細胞克隆哺乳動物自此成為動物界的“明星”， 也徹底顛覆了人類對生殖發育經典理論的認識。
資料圖：兩隻體細胞克隆猴。 中科院神經所供圖。
“多莉”誕生22年之後， 和人類最為接近的靈長類動物食蟹猴的克隆體誕生。 這一次， 突破性成果發生地是中國。 中國科學院神經科學研究所孫強、蒲慕明領導的研究團隊為最先誕生的這兩隻克隆猴取名為“中中”和“華華”。
該項成果歷時5年， 相關論文則於1月25日以封面文章的形式被《細胞》(Cell)雜誌。 罕見的是， 論文從投稿到接收甚至歷時不到一個月。 這或許一定程度上反映了蒲慕明等人希望在世界範圍內佔據“克隆猴”優勢的急切， “中國只比國外領先一年”， 蒲慕明如此提及。
中國科學院院士季維智在接受澎湃新聞(www.thepaper.cn)採訪時同樣表示，
季維智是靈長類動物研究領域的權威， 現任昆明理工大學靈長類轉化醫學院院長。 上世紀90年代末， 季維智在全球最頂級的非人靈長類研究機構——美國俄勒岡國家靈長類研究中心做訪問學者。
當然， 這並不是意味著“克隆猴”能夠輕易完成， 而是二十餘年時間裡久未出現進展的克隆技術在2014年終於有所突破， 科學家對“克隆”的干預逐漸找到方向， 一定程度上提高了克隆效率。
值得一提的是， 在中國首創“克隆猴”之際， 外界會聯想到該領域曾經的領跑者美國——為何美國沒能成功？答案是， 2000年之後， 美國科學界對克隆猴由“雄心勃勃”轉為近乎 “偃旗息鼓”。
美國“克隆猴”逐漸偃旗息鼓， 並將研究的重心轉向以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術， 但大洋彼岸的中國科學家卻沒有停下腳步。 “一個是實驗經費的問題， 另一個是集中精力的問題， 所以由中國創造了目前這個結果是很自然的。 ”季維智表示。
“克隆猴”技術難點
“多莉”誕生至今已有超過20種哺乳動物實現克隆， 其技術均為體細胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer， 簡稱“SCNT”)。 該技術原理並不複雜， 研究人員將一種體細胞培養後注入去除遺傳物質的卵子， 通過人工方法啟動後再移植到代孕母體發育成個體。
而克隆的核心在於， 如何讓已經高度分化的體細胞重新變回分化前的狀態， 這種類似“時光逆轉”的反自然過程被稱為“重程式設計”。 季維智提到， “克隆難點就在於體細胞， 科學家要解決的一個基本的科學問題就是， 如何把高度分化的細胞變成多能性， 具備像精子一樣的功能。 ”
長期從事克隆研究的中國科學院廣州生物醫藥與健康研究員、世界首例基因編輯克隆犬“龍龍”的培育者賴良學在接受澎湃新聞(www.thepaper.cn)採訪時表示， “重程式設計是一個很複雜的過程， 把細胞核放進一個卵子， 這個卵子的環境是我們控制不了的。 這就像我們把一個石頭扔到一個大海裡面， 這個石頭具體到了哪兒， 將來流向哪裡，
根據孫強的介紹， 克隆猴主要有三個難點。 首先是細胞核不易識別， “去核”難度大。 其次， 克隆過程中， 體細胞的細胞核進入卵細胞時， 需先“喚醒”卵細胞， 然後才啟動一系列發育“程式”， 但卵細胞容易提前啟動。 最後， 體細胞克隆胚胎的發育效率低， 絕大多數克隆胚胎都難以正常發育， 往往胎死腹中。
在孫強團隊的研究中， 團隊最終利用猴胎兒成纖維細胞進行核移植。 最終將79枚克隆胚胎(處於二細胞期至囊胚期)移植入21只代孕母猴中， 最終4只代孕成功的母猴有兩隻流產， 剩下兩隻正常懷孕超過140天， 然後通過剖腹產手段獲得兩隻存活的猴， 即“中中”和“華華”
“中中”和“華華”誕生的墊腳石
體細胞重程式設計的難以控制，使得動物克隆效率極為低下，長期停留在1%以下的水準。
對於此次克隆猴的成功，未曾走出國門留學、自稱“土鼈一代”的孫強率領的團隊毫無疑問是功臣，其中諸多媒體爭相報導的即是論文第一作者劉真博士耗時3年訓練的快速“去核”、“注核”的本事。
蒲慕明提到劉真時表示，“體細胞核移植技術流程非常關鍵，操作越快，卵細胞受損就會越小，劉博士在這方面做的很出色。劉真可能在10秒之內對卵母細胞進行細胞去核操作，在15秒之內將體細胞注入到卵母細胞當中。”在蒲慕明和孫強的眼裡，就細胞“去核”、“注核”技術，劉真是當之無愧的“世界冠軍”。
對於孫強團隊的成功，季維智表示，“顯微操作的時候技術熟練是條件之一，另一個成功的關鍵在於他們找到了體細胞去甲基化、乙醯化的合適配方。”談及體細胞的去甲基化、乙醯化，繞不開孫強團隊成功的墊腳石。
體細胞甲基化、乙醯化實際上都是體細胞重程式設計過程中的表觀遺傳修飾障礙。無論DNA、RNA還是蛋白質，其表面均有例如甲基、乙醯基等的額外基團，這些基團就被稱為“修飾”，它們受細胞狀態影響，也能反過來影響細胞狀態。
克服表觀遺傳修飾障礙的轉機出現在2014年。華裔科學家、美國哈佛醫學院教授張毅實驗室的研究發現，在體細胞核移植實驗中，組蛋白H3K9me3的修飾所介導的轉錄沉默是阻擋細胞重程式設計進行的“屏障”，加入去甲基化酶Kdm4d就可以使得重程式設計效率大大增加。
隨後的2016年，上海同濟大學的高紹榮團隊也發現，聯合使用去甲基化酶Kdm4b和Kdm5b能極大提高小鼠克隆胚胎的囊胚率及出生率。而早在2006年，日本理化學研究所RIKEN的Wakayama團隊則發現TSA能提高小鼠克隆效率，TSA就是一種乙醯化酶抑制劑。
賴良學表示，“在張毅的這項研究之前，各個實驗室也都在想辦法進行干預，但大都沒找到關鍵點。”而季維智上述提到的“合適配方”指的則是，孫強團隊此番在體細胞核移植體系中找到了TSA和Kdm4d的理想濃度組合。
由此看來，“中中”和“華華”的誕生實際上並不是單個實驗室的成果，更像是克隆領域近幾年發展的一項集成。高紹榮在點評該成果時也表示，“離不開科學家們長期以來對克隆胚胎重程式設計機制的研究”。也正是基於科學家近年來的突破性進展，季維智才認為，“克隆猴確實只是一個時間問題了。”
2000年後美國基本“偃旗息鼓”
中國此番獲得全球首例克隆猴，被稱為“彎道超車”。
曾經克隆猴領域的領跑者當屬美國。曾被科學界認為最可能第一個克隆出猴子的即是美國俄勒岡靈長類研究中心的著名科學家美籍哈薩克科學家沙烏科萊特 米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)。
早在2007年，米塔利波夫團隊在《自然》發表成果：利用細胞核轉移技術，成功用猴子皮膚細胞克隆出胚胎，並提取出兩個幹細胞系。這是人類首次以體細胞克隆的方式獲得靈長類胚胎。
2010年，米塔利波夫率領團隊更是成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎發育至81天，以流產告終。這也是在孫強團隊完成克隆之前，全球離實現克隆猴距離最近的一項研究。
而在米塔利波夫之前，美國的科學家在2000年時曾宣佈用胚胎分裂的方式對猴進行克隆。研究人員把107個猴胚胎分裂成368個胚胎，結果有4個發育成熟但胎死腹中，只有一隻在胚胎分裂157天之後幸運地降生。這只也就是曾經一度被稱為首次成功克隆獲得的靈長類動物“Tetra”。
但實際上，胚胎分裂方式並不是真正意義上的的體細胞克隆，因此也未引起過多關注。
然而，除了米塔利波夫團隊，美國在克隆研究的巔峰期之後又如何看待這項研究？季維智和賴良學都提及，“近十幾年來，美國已鮮有實驗室研究克隆候。”
賴良學提及，Schatten在2000年左右提出的基於“多莉”的克隆技術實現克隆猴是“行不通的”，這無疑是給美國克隆研究“潑了冷水”。
“Schatten當時用體細胞克隆，他認為胚胎發育超越不了八細胞期(哺乳動物早期胚胎發育的一個階段)。”季維智也同樣表示，“實際上，我們在2007年就把這個觀點否定掉了，我們當時就發現是可以達到囊胚階段的。並且還證明了，跟正常的胚胎相比，克隆胚胎在八細胞期和二細胞期的時候確實是有很高的DNA甲基化水準。”該項研究由季維智和中科院動物所周琪團隊合作完成，也是首次證明了克隆胚胎的甲基化水準異常。
針對克隆猴近十幾年來在美國遇冷的現象，賴良學認為，“猴子畢竟是靈長類動物，成本很高，不像其它實驗一樣，各種方法、技術都去試。如果一段時間試不出來，經費又用完了，很多實驗室可能也就停掉了克隆實驗。”
不過，在季維智看來，經費、甚至猴子資源都不是美國近十幾年來在克隆猴方面遇冷的根本原因。“這些有一定影響，但關鍵是美國的興奮點沒有放在克隆上面了，而是轉向了基因編輯等其他領域。”
此番克隆猴的出現，會在全球範圍內再次刮起一場克隆巔峰嗎？答案拭目以待。不過，蒲慕明在成果發佈之際曾提到，“基因編輯在胚胎克隆上有很多問題無法解決，比如脫靶等。但在體細胞克隆上進行基因編輯時，這些問題都比較容易解決。”
體細胞重程式設計的難以控制，使得動物克隆效率極為低下，長期停留在1%以下的水準。
對於此次克隆猴的成功，未曾走出國門留學、自稱“土鼈一代”的孫強率領的團隊毫無疑問是功臣，其中諸多媒體爭相報導的即是論文第一作者劉真博士耗時3年訓練的快速“去核”、“注核”的本事。
蒲慕明提到劉真時表示，“體細胞核移植技術流程非常關鍵，操作越快，卵細胞受損就會越小，劉博士在這方面做的很出色。劉真可能在10秒之內對卵母細胞進行細胞去核操作，在15秒之內將體細胞注入到卵母細胞當中。”在蒲慕明和孫強的眼裡，就細胞“去核”、“注核”技術，劉真是當之無愧的“世界冠軍”。
對於孫強團隊的成功，季維智表示，“顯微操作的時候技術熟練是條件之一，另一個成功的關鍵在於他們找到了體細胞去甲基化、乙醯化的合適配方。”談及體細胞的去甲基化、乙醯化，繞不開孫強團隊成功的墊腳石。
體細胞甲基化、乙醯化實際上都是體細胞重程式設計過程中的表觀遺傳修飾障礙。無論DNA、RNA還是蛋白質，其表面均有例如甲基、乙醯基等的額外基團，這些基團就被稱為“修飾”，它們受細胞狀態影響，也能反過來影響細胞狀態。
克服表觀遺傳修飾障礙的轉機出現在2014年。華裔科學家、美國哈佛醫學院教授張毅實驗室的研究發現，在體細胞核移植實驗中，組蛋白H3K9me3的修飾所介導的轉錄沉默是阻擋細胞重程式設計進行的“屏障”，加入去甲基化酶Kdm4d就可以使得重程式設計效率大大增加。
隨後的2016年，上海同濟大學的高紹榮團隊也發現，聯合使用去甲基化酶Kdm4b和Kdm5b能極大提高小鼠克隆胚胎的囊胚率及出生率。而早在2006年，日本理化學研究所RIKEN的Wakayama團隊則發現TSA能提高小鼠克隆效率，TSA就是一種乙醯化酶抑制劑。
賴良學表示，“在張毅的這項研究之前，各個實驗室也都在想辦法進行干預，但大都沒找到關鍵點。”而季維智上述提到的“合適配方”指的則是，孫強團隊此番在體細胞核移植體系中找到了TSA和Kdm4d的理想濃度組合。
由此看來，“中中”和“華華”的誕生實際上並不是單個實驗室的成果，更像是克隆領域近幾年發展的一項集成。高紹榮在點評該成果時也表示，“離不開科學家們長期以來對克隆胚胎重程式設計機制的研究”。也正是基於科學家近年來的突破性進展，季維智才認為，“克隆猴確實只是一個時間問題了。”
2000年後美國基本“偃旗息鼓”
中國此番獲得全球首例克隆猴，被稱為“彎道超車”。
曾經克隆猴領域的領跑者當屬美國。曾被科學界認為最可能第一個克隆出猴子的即是美國俄勒岡靈長類研究中心的著名科學家美籍哈薩克科學家沙烏科萊特 米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)。
早在2007年，米塔利波夫團隊在《自然》發表成果：利用細胞核轉移技術，成功用猴子皮膚細胞克隆出胚胎，並提取出兩個幹細胞系。這是人類首次以體細胞克隆的方式獲得靈長類胚胎。
2010年，米塔利波夫率領團隊更是成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎發育至81天，以流產告終。這也是在孫強團隊完成克隆之前，全球離實現克隆猴距離最近的一項研究。
而在米塔利波夫之前，美國的科學家在2000年時曾宣佈用胚胎分裂的方式對猴進行克隆。研究人員把107個猴胚胎分裂成368個胚胎，結果有4個發育成熟但胎死腹中，只有一隻在胚胎分裂157天之後幸運地降生。這只也就是曾經一度被稱為首次成功克隆獲得的靈長類動物“Tetra”。
但實際上，胚胎分裂方式並不是真正意義上的的體細胞克隆，因此也未引起過多關注。
然而，除了米塔利波夫團隊，美國在克隆研究的巔峰期之後又如何看待這項研究？季維智和賴良學都提及，“近十幾年來，美國已鮮有實驗室研究克隆候。”
賴良學提及，Schatten在2000年左右提出的基於“多莉”的克隆技術實現克隆猴是“行不通的”，這無疑是給美國克隆研究“潑了冷水”。
“Schatten當時用體細胞克隆，他認為胚胎發育超越不了八細胞期(哺乳動物早期胚胎發育的一個階段)。”季維智也同樣表示，“實際上，我們在2007年就把這個觀點否定掉了，我們當時就發現是可以達到囊胚階段的。並且還證明了，跟正常的胚胎相比，克隆胚胎在八細胞期和二細胞期的時候確實是有很高的DNA甲基化水準。”該項研究由季維智和中科院動物所周琪團隊合作完成，也是首次證明了克隆胚胎的甲基化水準異常。
針對克隆猴近十幾年來在美國遇冷的現象，賴良學認為，“猴子畢竟是靈長類動物，成本很高，不像其它實驗一樣，各種方法、技術都去試。如果一段時間試不出來，經費又用完了，很多實驗室可能也就停掉了克隆實驗。”
不過，在季維智看來，經費、甚至猴子資源都不是美國近十幾年來在克隆猴方面遇冷的根本原因。“這些有一定影響，但關鍵是美國的興奮點沒有放在克隆上面了，而是轉向了基因編輯等其他領域。”
此番克隆猴的出現，會在全球範圍內再次刮起一場克隆巔峰嗎？答案拭目以待。不過，蒲慕明在成果發佈之際曾提到，“基因編輯在胚胎克隆上有很多問題無法解決，比如脫靶等。但在體細胞克隆上進行基因編輯時，這些問題都比較容易解決。”