作者： 陳遠松， 朱曉偉， 龔翔宇， 梅至誠， 祝彪
作者單位：浙江農林大學農業與食品科學學院， 生物種業研究中心
摘要:抗病育種是當前番茄育種的一個重要方向， 分子標記技術已成為番茄抗病育種中的重要方法之一。 分子標記技術很大程度上克服了表型選擇的局限性， 能極大地縮短育種週期， 已廣泛應用於番茄的輔助育種。 文章基於獻計量分析的方法， 綜述了分子標記技術在中國番茄抗病育種應用上的研究現狀， 介紹了常用幾種分子標記的特點， 概述了番茄主要病害抗病分子標記使用現狀及進展，
番茄品種豐富、種植廣泛、營養價值高， 富含具有抗癌效果的番茄紅素等抗氧化物質， 但其病害種類繁多、危害嚴重。 目前， 生產上對番茄病害的防治主要依賴于噴施化學藥劑， 這不但會帶來食品安全問題， 而且增加成本， 污染環境。 此外， 隨著病菌和害蟲對藥物的抗性逐漸增強， 殺菌劑、殺蟲劑的功效也大大減弱。 因此， 在番茄育種中培育優良的抗病品種顯得尤為重要。
此前， 絕大多數番茄品種是通過表型篩選和傳統育種得到的。 隨著分子標記和分子標記輔助選擇技術的出現， 番茄遺傳育種研究已進入一個新的時代。 Rick等最早在番茄育種領域應用DNA分子標記技術進行初探，
本文採用文獻計量分析的方法， 從文獻時間分佈、文獻來源地區分佈、文獻來源機構、各類分子標記使用次數分析和各種番茄病害文獻數量分析等幾個方面對國內番茄抗病分子標記的應用現狀進行研究分析，
1.資料來源與研究方法
1.1文獻獲取期刊和學位論文獲取:
以《中國知識資源總庫(CNKI)》為資料來源。 採用高級檢索類型， 以“主題”為檢索項， 以“番茄”並含“標記”為檢索詞， 採用“精確”匹配為檢索式， 文獻檢索時間範圍為2000年1月1日至2015年12月31日， 檢索庫範圍為期刊、特色期刊和學位論文。
專利文獻獲取:以《國家智慧財產權局互聯網檢索資料庫》為資料來源， 利用Soopat專利搜索平臺， 在中國專利欄輸入“番茄標記”， 檢索範圍設為“發明、實用新型、發明授權”。
1.2統計分析方法
首先建立Excel資料庫， 然後根據分析需求， 分別建立不同的工作表和不同的欄位，
2.結果與分析
2.1分子標記在我國番茄抗病育種中的運用
根據上述方法檢索得到期刊文獻360篇、學位論文445篇、專利153篇， 其中226篇涉及番茄性狀相關分子標記。 上述文獻中， 抗病相關的占71%;抗逆性的占7%;果實品質、產量的占11%;品種、純度鑒定的占7%;雄性不育、單性結實的占4%(圖1)。 顯然， 分子標記在抗病性狀的研究上應用最多。 排除了與分子標記無關和分子標記在其他方面應用等文獻以及資料不全的期刊和學位論文， 排除了不在2000—2015年的專利、與分子標記無關和分子標記在其他方面應用等文獻以及資料不全的專利， 最終得到番茄抗病分子標記相關期刊文獻85篇，
2.2文獻的年份分佈
由圖2可知， 2000—2015年文獻的發表數量總體呈上升趨勢， 這表明科研工作者對分子標記在番茄抗病育種中的研究熱度增加且不斷深入。 期刊和專利發表量基本呈現穩定上漲的趨勢， 而學位論文在不同年份間波動較大。從總體數量上來看，期刊最多，學位論文第二，專利最少。
2.3文獻來源分析
2.3.1文獻數目地域分析
文獻的地域分佈整體上表現為東部多於西部，北方多於南方，主要集中于東北農業大學，以中國農業科學院為代表的北京周邊科研機構與大學，浙江、江蘇地區的大學與農業科學院。其中東北農業大學十分熱衷於番茄抗病分子標記的研究與運用，131篇學位論文和期刊論文中有35篇來自東北農業大學。
2.3.2幾種主要病害研究的地域分佈
根據圖3可以發現，番茄抗病分子標記研究與番茄產地以及主要病害發生的地理分佈密切相關，如北方地區對番茄花葉病毒病(ToMV)和根結線蟲病(rootknotnematodes)的研究較多，而南方地區對此研究較少;對番茄花葉病毒病的研究以中國農業科學院為主，但其對番茄黃化曲葉病毒病(TYLCV)的研究較少;對青枯病(bacterialwilt)分子標記相關研究較少，主要集中在浙江大學和浙江省農業科學院等南方地區科研機構;東北農業大學對番茄主要病害相關分子標記都有所研究。
2.4番茄抗病育種中應用的主要分子標記分析
從圖4可以看出，特定序列擴增(sequencecharacterizedamplifiedregions，SCAR)標記的使用次數最多。擴增片段長度多態性(amplifiedfrag-mentlengthpolymorphism，AFLP)標記、簡單重複序列標記(simplesequencerepeat，SSR)、酶切擴增多態性序列標記(cleavedamplifiedpolymor-phismsequences，CAPS)使用次數也較多，僅次於SCAR標記。進一步研究表明，番茄不同病蟲害所使用的分子標記不同。
圖5表明，番茄花葉病毒病主要使用SCAR標記，很少使用其他標記;青枯病主要使用AFLP標記;根結線蟲病主要使用SCAR標記和CAPS標記;葉黴病(leafmold)很少使用SCAR標記;SSR標記的病害比例與AFLP標記很相似，實際上SSR標記和AFLP標記經常聯合使用。
從表2可以看出，分子標記在番茄抗病育種中的使用情況與他們自身的特點密切相關。限制性片段長度多態性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)技術最主要的缺點是由於它的產生是由堿基突變致使限制性酶切位點的獲得或失去，故多態位點少，信息量小。隨機擴增多態性DNA(randomamplifiedpolymorphismDNA，RAPD)技術受影響的因素多，實驗重複性和穩定性差。CAPS分子標記技術依賴於已發現的突變酶切點。AFLP技術需要使用同位素檢測。SSR標記必須依賴測序設計引物。單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)標記建立在大量測序或基因晶片的基礎上。相較其他標記，SCAR標記具有多態性高、穩定性和重複性好、使用簡單、費用較低等明顯優勢，所以它在番茄抗病研究上的使用最多。然而實際研究中可能影響分子標記使用的因素有很多，如分子標記開發難度、已開發的標記數目、標記的使用效果和標記的使用成本等都會影響標記使用。
2.5番茄主要病害的分子標記使用情況分析
由圖6得知，分子標記在黃化曲葉病毒病上的運用遠多於其他病害。葉黴病和根結線蟲病也是運用分子標記較多的病害。黃化曲葉病毒病使用分子標記最多的原因可能與其病害危害嚴重、防治難度大，且傳統育種進展緩慢、困難大，黃化曲葉病毒病抗性是一種品質性狀、使用分子標記育種操作難度低且抗病效果明顯有關。目前，已經定位到的黃化曲葉病毒病抗病基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和Ty-5，開發的標記種類和數目較多且經過驗證。
由圖7可知，不同病害使用的標記具有較大差異，黃化曲葉病毒病使用最多的4種標記也是總體使用最多的分子標記，使用量最大的SCAR標記在葉黴病上卻使用較少，根結線蟲病很少使用AFLP和SSR標記。
3.討論
分子標記技術已成為番茄育種中重要的工具之一。本文通過文獻計量分析的方法對我國番茄抗病分子標記的研究進展進行了分析，結果表明，分子標記技術在番茄抗病育種上的應用正在快速增加。國內番茄抗病分子標記的研究具有明顯的地域性特點，這與番茄栽培產地實際和國內主要農業研究機構的地域分佈基本吻合。各類型的分子標記都在廣泛使用，其中SCAR標記的使用量最大。不同病害使用分子標記情況不同，黃化曲葉病毒病是當前比較熱門的研究物件。從已發表文獻看，目前國內對於番茄抗病分子標記的研究主要集中在科研機構，國內育種公司在這方面的研究還不足，與國外的大公司仍有不小的差距。即使是國內在番茄抗病分子標記研究方面基礎較好的單位，目前的主要工作還在於對現有標記的研究和應用上，很少有國內自主開發的新標記。隨著分子標記技術在番茄育種上的應用越來越多，自主開發新標記和育種公司參與分子標記的應用研究將會是我國未來對番茄抗病分子標記研究和應用的主要方向。
而學位論文在不同年份間波動較大。從總體數量上來看，期刊最多，學位論文第二，專利最少。2.3文獻來源分析
2.3.1文獻數目地域分析
文獻的地域分佈整體上表現為東部多於西部，北方多於南方，主要集中于東北農業大學，以中國農業科學院為代表的北京周邊科研機構與大學，浙江、江蘇地區的大學與農業科學院。其中東北農業大學十分熱衷於番茄抗病分子標記的研究與運用，131篇學位論文和期刊論文中有35篇來自東北農業大學。
2.3.2幾種主要病害研究的地域分佈
根據圖3可以發現，番茄抗病分子標記研究與番茄產地以及主要病害發生的地理分佈密切相關，如北方地區對番茄花葉病毒病(ToMV)和根結線蟲病(rootknotnematodes)的研究較多，而南方地區對此研究較少;對番茄花葉病毒病的研究以中國農業科學院為主，但其對番茄黃化曲葉病毒病(TYLCV)的研究較少;對青枯病(bacterialwilt)分子標記相關研究較少，主要集中在浙江大學和浙江省農業科學院等南方地區科研機構;東北農業大學對番茄主要病害相關分子標記都有所研究。
2.4番茄抗病育種中應用的主要分子標記分析
從圖4可以看出，特定序列擴增(sequencecharacterizedamplifiedregions，SCAR)標記的使用次數最多。擴增片段長度多態性(amplifiedfrag-mentlengthpolymorphism，AFLP)標記、簡單重複序列標記(simplesequencerepeat，SSR)、酶切擴增多態性序列標記(cleavedamplifiedpolymor-phismsequences，CAPS)使用次數也較多，僅次於SCAR標記。進一步研究表明，番茄不同病蟲害所使用的分子標記不同。
圖5表明，番茄花葉病毒病主要使用SCAR標記，很少使用其他標記;青枯病主要使用AFLP標記;根結線蟲病主要使用SCAR標記和CAPS標記;葉黴病(leafmold)很少使用SCAR標記;SSR標記的病害比例與AFLP標記很相似，實際上SSR標記和AFLP標記經常聯合使用。
從表2可以看出，分子標記在番茄抗病育種中的使用情況與他們自身的特點密切相關。限制性片段長度多態性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)技術最主要的缺點是由於它的產生是由堿基突變致使限制性酶切位點的獲得或失去，故多態位點少，信息量小。隨機擴增多態性DNA(randomamplifiedpolymorphismDNA，RAPD)技術受影響的因素多，實驗重複性和穩定性差。CAPS分子標記技術依賴於已發現的突變酶切點。AFLP技術需要使用同位素檢測。SSR標記必須依賴測序設計引物。單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)標記建立在大量測序或基因晶片的基礎上。相較其他標記，SCAR標記具有多態性高、穩定性和重複性好、使用簡單、費用較低等明顯優勢，所以它在番茄抗病研究上的使用最多。然而實際研究中可能影響分子標記使用的因素有很多，如分子標記開發難度、已開發的標記數目、標記的使用效果和標記的使用成本等都會影響標記使用。
2.5番茄主要病害的分子標記使用情況分析
由圖6得知，分子標記在黃化曲葉病毒病上的運用遠多於其他病害。葉黴病和根結線蟲病也是運用分子標記較多的病害。黃化曲葉病毒病使用分子標記最多的原因可能與其病害危害嚴重、防治難度大，且傳統育種進展緩慢、困難大，黃化曲葉病毒病抗性是一種品質性狀、使用分子標記育種操作難度低且抗病效果明顯有關。目前，已經定位到的黃化曲葉病毒病抗病基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和Ty-5，開發的標記種類和數目較多且經過驗證。
由圖7可知，不同病害使用的標記具有較大差異，黃化曲葉病毒病使用最多的4種標記也是總體使用最多的分子標記，使用量最大的SCAR標記在葉黴病上卻使用較少，根結線蟲病很少使用AFLP和SSR標記。
3.討論
分子標記技術已成為番茄育種中重要的工具之一。本文通過文獻計量分析的方法對我國番茄抗病分子標記的研究進展進行了分析，結果表明，分子標記技術在番茄抗病育種上的應用正在快速增加。國內番茄抗病分子標記的研究具有明顯的地域性特點，這與番茄栽培產地實際和國內主要農業研究機構的地域分佈基本吻合。各類型的分子標記都在廣泛使用，其中SCAR標記的使用量最大。不同病害使用分子標記情況不同，黃化曲葉病毒病是當前比較熱門的研究物件。從已發表文獻看，目前國內對於番茄抗病分子標記的研究主要集中在科研機構，國內育種公司在這方面的研究還不足，與國外的大公司仍有不小的差距。即使是國內在番茄抗病分子標記研究方面基礎較好的單位，目前的主要工作還在於對現有標記的研究和應用上，很少有國內自主開發的新標記。隨著分子標記技術在番茄育種上的應用越來越多，自主開發新標記和育種公司參與分子標記的應用研究將會是我國未來對番茄抗病分子標記研究和應用的主要方向。