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【Science 重磅！】強千倍！全新螢光素酶讓深層組織單細胞成像不再是夢！
作者：Razor
生物發光（bioluminescence）， 是指生物體或生物體提取物發光的現象。
在生物世界裡說到發光， 人們首先會想到螢火蟲。 和大多數生物發光相似， 螢火蟲的發光依賴於螢光素（D-luciferin）和螢光素酶（luciferase）兩種物質。 活體生物發光成像（BLI）技術是一種無創分析生物體腫瘤細胞移植和檢測神經元活性的方法， 其最廣泛使用的螢光素即D-luciferin。 然而， D-luciferin具有組織穿透性低、酶親和力低以及血腦屏障通透性差等缺點， 為此技術帶來了很大的局限性。
近年來，
科研工作者人工合成了AkaLumine-HCl等多種。
在螢火蟲螢光素酶（Fluc）的作用下，
AkaLumine-HCl會釋放677nm近紅外光，
組織通透性強。
此外，
AkaLumine-HCl在機體內主要分佈在肺臟等深部器官當中，
這些器官正是Fluc的高表達區域。
但是，
Fluc的酶親和力不高，
因此並不是AkaLumine-HCl的最優螢光素酶。
2018年2月23日， Science刊登了RIKEN腦科學研究所A.Miyawaki研究組的最新重要工作[1]， 他們開發了一種新型螢光素酶， 使螢光素AkaLumine-HCl的螢光強度提升了100-1000倍， 在小鼠和靈長類動物中實現了深部組織發光視覺化，
A. Miyawaki教授
結果
1
AkaLumine和D-luciferin發光成像的對比
首先， 作者通過突變體篩選方法， 開發出一種新型螢光素酶——Akaluc。 接下來， 作者通過cDNA轉染的方式， 在Hela細胞中表達Akaluc或Fluc， 得到Hela/Akaluc和Hela/Fluc細胞株。 他們發現Akaluc的表達水準是Fluc的4倍，
然後， 作者希望在體對比2種螢光素/螢光素酶的發光成像水準。 他們提前在小鼠體內注射飽和劑量的AkaLumine-HCl或D-luciferin， 並在尾靜脈中注射Hela/Akaluc或Hela/Fluc細胞， 發現小鼠肺部AkaLumine-HCl/Akaluc的發光信號是D-luciferin/Fluc的52倍；他們又在小鼠的紋狀體中注射AAV來表達Akaluc或Fluc， 發現AkaLumine-HCl/Akaluc的發光信號是D-luciferin/Fluc的1408倍（圖1）。
這些結果表明， 無論體外還是在體， AkaLumine-HCl/Akaluc系統的生物發光效率顯著高於D-luciferin/Fluc系統。 在後文中， 我們用AkaBLI來表示AkaLumine-HCl/Akaluc系統。
圖1 人工合成螢光素AkaLumine和天然螢光素D-luciferin發光成像對比
2
AkaBLI系統定量分析Hela細胞的肺部移植效率
由於Hela/Akaluc細胞的生物發光信號很強， 作者將AkaBLI用作定量方法來研究Hela細胞在小鼠肺部的移植效率。 他們在12只小鼠的尾靜脈中分別注射含1個Hela/Akaluc細胞的溶液， 發現只有2只小鼠的肺部有發光信號。 若注射含2個細胞的溶液， 5/9的小鼠肺部有發光信號；若注射含3個細胞的溶液， 9/10的小鼠肺部有發光信號。 上述信號均為單焦點信號。 而當注射含10個細胞的溶液時， 4/6的小鼠肺部有單焦點發光信號， 1/6小鼠的肺部呈現出雙焦點信號。 光信號總強度和注射細胞的數量線性相關（圖2）。
這些結果表明，Hela細胞很可能在移植進入肺部之前就聚集成群，而且集群越大，移植進入肺部的概率越高。這些結論與過去的研究結果一致。
圖2 AkaBLI系統定量分析Hela/Akaluc細胞的肺部移植效率
3
AkaBLI系統無創檢測小鼠大腦海馬CA1的活性
接下來，作者將AkaBLI發光成像技術應用於神經科學。他們在c-fos tTA小鼠的海馬CA1中注射AAV-TRE-Venus-Akaluc，只有表達c-fos的神經元（被啟動的神經元）才能表達Venus-Akaluc螢光素酶。過去的研究表明，探索新奇環境會啟動小鼠海馬CA1神經元。在此實驗中，作者發現小鼠探索新奇環境7小時之後，其CA1區域的發光信號顯著增強（圖3），表明AkaBLI可以無創高效檢測大腦神經元活性。
圖3 AkaBLI系統無創檢測小鼠大腦海馬CA1的活性
4
AkaBLI系統在狨猴大腦紋狀體中的成像
在齧齒動物中驗證AkaBLI之後，作者希望在更高級的靈長類動物中使用AkaBLI系統長時間檢測神經元活性。他們在一隻4歲雌性狨猴的右側紋狀體中注射AAV來表達Akaluc，腹腔注射AkaLumine-HCl後麻醉狨猴並成像，每個月1次。他們發現，腹腔注射後第3個月，紋狀體發光信號明顯增強，並可持續數月。注射後1年，依然可以檢測到自由活動狨猴的發光信號（圖4）。這些結果表明AkaBLI系統非常穩定、持久，並可應用於靈長類動物。
圖4 AkaBLI系統在狨猴大腦紋狀體中的成像
總結
生物發光成像技術應用廣泛，而其必需的螢光素有很大局限性。天然螢光素D-luciferin組織穿透性低、酶親和力低、血腦屏障通透性差，人工合成螢光素AkaLumine找不到對應的生物酶。
本篇重要文章開發了一種新型螢光素酶，使AkaLumine的螢光強度提升了100-1000倍，進而組成AkaBLI系統。該系統可以在多種動物中無創定量分析腫瘤移植以及長時程檢測神經元活性，有極大潛力推動醫學、藥理學以及神經科學的發展！
這些結果表明，Hela細胞很可能在移植進入肺部之前就聚集成群，而且集群越大，移植進入肺部的概率越高。這些結論與過去的研究結果一致。
圖2 AkaBLI系統定量分析Hela/Akaluc細胞的肺部移植效率
3
AkaBLI系統無創檢測小鼠大腦海馬CA1的活性
接下來，作者將AkaBLI發光成像技術應用於神經科學。他們在c-fos tTA小鼠的海馬CA1中注射AAV-TRE-Venus-Akaluc，只有表達c-fos的神經元（被啟動的神經元）才能表達Venus-Akaluc螢光素酶。過去的研究表明，探索新奇環境會啟動小鼠海馬CA1神經元。在此實驗中，作者發現小鼠探索新奇環境7小時之後，其CA1區域的發光信號顯著增強（圖3），表明AkaBLI可以無創高效檢測大腦神經元活性。
圖3 AkaBLI系統無創檢測小鼠大腦海馬CA1的活性
4
AkaBLI系統在狨猴大腦紋狀體中的成像
在齧齒動物中驗證AkaBLI之後，作者希望在更高級的靈長類動物中使用AkaBLI系統長時間檢測神經元活性。他們在一隻4歲雌性狨猴的右側紋狀體中注射AAV來表達Akaluc，腹腔注射AkaLumine-HCl後麻醉狨猴並成像，每個月1次。他們發現，腹腔注射後第3個月，紋狀體發光信號明顯增強，並可持續數月。注射後1年，依然可以檢測到自由活動狨猴的發光信號（圖4）。這些結果表明AkaBLI系統非常穩定、持久，並可應用於靈長類動物。
圖4 AkaBLI系統在狨猴大腦紋狀體中的成像
總結
生物發光成像技術應用廣泛，而其必需的螢光素有很大局限性。天然螢光素D-luciferin組織穿透性低、酶親和力低、血腦屏障通透性差，人工合成螢光素AkaLumine找不到對應的生物酶。
本篇重要文章開發了一種新型螢光素酶，使AkaLumine的螢光強度提升了100-1000倍，進而組成AkaBLI系統。該系統可以在多種動物中無創定量分析腫瘤移植以及長時程檢測神經元活性，有極大潛力推動醫學、藥理學以及神經科學的發展！