當激酶活性可以用光控制後會發生什麼？

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2017年2月24日， science雜誌發表了斯坦福大學MichaelZ. Lin組蛋白改造方面的文章， 題目為“Optical controlof cell signaling by single- chain photoswitchablekinases”。 文章主要內容是設計了受光調控的激酶蛋白， 可以對細胞內的信號通路進行人為控制。

引言：

此前， 大家已經發現了許多自然界存在的光敏蛋白結構域， 主要通過改變細胞內定位、異構調節、扣留或者片段補償等方式實現利用光照改變蛋白的活性， 但是沒有真正意義上的不受細胞內定位影響的光控激酶被報導。

正文：

作者首先尋找合適的受光調控的可二聚化的結構域， 因為自然界不存在，

所以作者從此前已經被報導的可以被可見光照射解聚的四聚體綠色螢光蛋白Dronpa145N， 通過引入突變打破了原先反向平行的二聚體表面， 使橫向的二聚體表面親和力加強， 並且為了提高二聚化的能力， 作者設計了可受光解離的Dronpa二聚體結構域， 並取名為pdDronpa1（圖1）。 這種結構域在500nm的青色光照射下會發生解聚而使自身螢光消失， 但是在400nm的紫色光下自身螢光又會恢復。 並且通過一系列生化實驗證明這個結構域適合形成分子內的二聚化。

圖1 pdDronpa1結構域的改造示意圖

接下來就是應用了。

作者首先選擇了影響細胞增殖、分化、遷移和凋亡過程的Raf-MEK-ERK信號通路。 通過將pdDronpa1結構域與MEK1的激酶結構域連接起來（如圖2A所示）， 稱為psMEK1。 然後將質粒轉入細胞，

發現500nm的青色光照射後細胞內的磷酸化ERK水準明顯增加， 其中未轉染質粒的細胞用血清刺激後磷酸化ERK水準增加是作為陽性對照， 因為血清中存在生長因數， 可以刺激細胞內這條信號通路啟動（如圖2B所示）。 另外， PsMEK1tight質粒是通過對結構域進行改造降低了細胞內的本底磷酸化ERK水準。 通過這個實驗可以看出psMEK1活性確實可以被青色光控制。

圖2 psMEK1在青色光照射下顯著增加pERK水準

既然設計的psMEK1酶活可以被人為控制， 那麼這個蛋白可以作為工具進行抑制劑篩選。 具體的策略是過表達psMEK1融合磷酸化ERK移位的報告基因（未磷酸化ERK在細胞核， 磷酸化ERK在細胞質）質粒（psMEK1-P2A-ERKKTR-mRuby）的細胞在藥物處理後再用500nm青色光照射， 如果抑制劑有作用， 磷酸化ERK主要在細胞核；如果抑制劑沒有作用， 磷酸化ERK轉移到細胞質（圖3A和B）。 從圖3C可以看出MEK和ERK的抑制劑是有作用的， 而EGFR和Raf的抑制劑並不起作用。

圖3 利用 psMEK1蛋白篩選RAS-Raf-MEK-ERK信號通路抑制劑

另外， 作者還鑒定到了RAS-Raf-MEK-ERK信號通路中的一個負反饋機制， 即磷酸化的ERK可以促進磷酸化的MEK發生去磷酸化， 從而避免ERK過度磷酸化啟動（圖4）。

圖4 pERK 負反饋抑制促進MEK去磷酸化

最後， 作者還想通過在活體動物體內檢測構建的psRaf1和psMEK1是否具有生理作用。 他們採用線蟲作為研究模型， 因為線蟲的尾部會因細菌感染而啟動Raf-MEK-ERK通路發生保護性的腫脹反應。 在wildtype組雖然用500nm青色光照射， 但是並沒有發現腫脹現象， 用啟動的MEK1和Raf1-CAAX載體轉入線蟲細胞後發現出現明顯的變化， 和文獻報導一致， 作為陽性對照。 接著， 可以發現psRaf1和psMEK1質粒轉入後在500nm青色光照射下可以誘導明顯的尾部腫脹表型（圖5）。

圖5 psRaf1和psMEK1過表達導致線蟲發生尾部腫脹反應

整篇文章顯示了作者們強大的蛋白改造能力，有興趣的同學可以看全文。pdfmp4

最後介紹一下通訊作者Michael Z. Lin博士和實驗室

Michael Z. Lin博士

Michael Z. Lin博士本科在哈佛取得文科學士學位，在UCLA取得醫學博士學位，然後又在哈佛師從生化和神經生物學系Michael Greenberg教授並取得哲學博士學位。獲得博士學位後去了諾貝爾獎獲得者錢永健實驗室從事博士後訓練。2009年獲得斯坦福大學兒科和生物工程系助理教授職位並建立自己的實驗室。在斯坦福主要研究螢光蛋白的改造，創造出神經活性和可塑性的新感應器蛋白，並可以用光控制蛋白的活性。Lin博士獲得眾多獎項，包括：Burroughs Wellcome Career Award forMedical Scientists, a Rita AllenScholar Award, 和Damon Runyon-Rachleff Innovation Award等。

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Michael Z. Lin博士

Michael Z. Lin博士本科在哈佛取得文科學士學位，在UCLA取得醫學博士學位，然後又在哈佛師從生化和神經生物學系Michael Greenberg教授並取得哲學博士學位。獲得博士學位後去了諾貝爾獎獲得者錢永健實驗室從事博士後訓練。2009年獲得斯坦福大學兒科和生物工程系助理教授職位並建立自己的實驗室。在斯坦福主要研究螢光蛋白的改造，創造出神經活性和可塑性的新感應器蛋白，並可以用光控制蛋白的活性。Lin博士獲得眾多獎項，包括：Burroughs Wellcome Career Award forMedical Scientists, a Rita AllenScholar Award, 和Damon Runyon-Rachleff Innovation Award等。