Nature：北生所邵峰研究組發表細胞焦亡研究論文

2017年5月1日， 國際學術權威刊物自然出版集團旗下《Nature》雜誌線上發表了北京生命科學研究所邵峰實驗室題為“Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a Gasdermin”的研究論文。 論文報導了caspase-3可以通過切割和活化GSDME (DFNA5)蛋白誘導細胞焦亡並進一步發現該焦亡通路是部分化療藥物產生毒副作用的重要原因之一。 邵峰實驗室研究生王玉鵬和高文青為本文共同第一作者， 邵峰博士為本文通訊作者。

細胞焦亡(pyroptosis)傳統是指由caspase蛋白酶家族成員caspase-1介導的、發生在單細胞中的一種促炎性的程式性細胞死亡， 但其性質和機制一直不清楚。 邵峰實驗室此前工作發現caspase-4/5/11， 作為細菌內毒素(LPS)的胞內受體，

在被LPS活化後也可誘導焦亡， 並且這種焦亡很多非單細胞中也發生， 是LPS導致膿毒症的關鍵機制(Shi et al., Nature 2014)。 過去兩年中， 邵峰實驗室還首次鑒定出了全新的GSDMD蛋白， 該蛋白是caspase-1和caspase-4/5/11的共有底物， 正常情況下處於自抑制狀態， 在被這些caspase切割後釋放出其N端具有膜打孔活性的結構域， 進而導致細胞脹大直至破裂(Shi et al., Nature 2015;Ding et al., Nature 2016)。 這些工作表明GSDMD是caspase-1/4/5/11誘導細胞焦亡的執行者， 也澄清了焦亡是一種細胞壞死的本質。 更為重要的是GSDMD代表了一個Gasdermin蛋白家族， 還包括GSDMA， GSDMB， GSDMC， DFNA5/GSDME和DFNB59， 該家族的N端結構域均具有膜打孔和誘導焦亡的活性(Ding et al., Nature 2016)。 因次， 他們最近也將焦亡重新定義為由Gasdermin蛋白介導的一種程式性細胞壞死(Shi et al., TiBS 2017)。

邵峰實驗室此前在研究GSDMD時發現， 將GSDMD的caspase-1/4/11切割位點置換成caspase-3切割位點可以將TNFa誘導caspase-3活化引起的HeLa細胞凋亡轉換為焦亡，

在後續對照實驗中， 他們又意外發現在細胞中表達野生型的GSDME也同樣可以將凋亡轉換為焦亡。 在分析蛋白序列後他們發現GSDME的N端和C端結構域之間有一個caspase-3切割位元點， 實驗結果顯示TNFa處理確實會導致GSDME的切割， 如通過突變切割位點抑制caspase-3的作用， 細胞則不再發生焦亡而恢復凋亡。 在體外生化實驗中， 純化的GSDME蛋白能被caspase-3特異性切割， 且切割位點和細胞內一致， 而切割效率顯著高於已知的caspase-3底物。 和GSDMD類似， caspase-3切割產生的GSDME的N端片段可以特異性結合4,5-二磷酸磷脂醯肌醇(PI(4,5)P2)並導致含有該磷脂的脂質體洩漏， 負染電鏡結果顯示切割活化的GSDME可以在脂質體膜上打孔。 這些結果說明GSDME是由caspase-3切割後活化， 進而在膜上打孔並觸發細胞焦亡。

進一步的研究發現， 多數常用的(癌)細胞系均不表達GSDME， 研究人員也只找到了人的神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y和惡性黑色素瘤細胞MeWo表達高水準的內源GSDME。 在這兩株細胞中， 他們用臨床常用的、導致DNA損傷的化療藥物誘導caspase-3活化後， 發現這兩株細胞均以焦亡的方式死去， 而不表達GSDME的Jurkat細胞， 則和通常認知一樣， 發生經典的凋亡。 後續的一系列細胞實驗也證明了SH-SY5Y細胞在化療藥物作用下發生的焦亡正是由於caspase-3切割GSDME導致的。 值得注意的是， 邵峰團隊在檢測了NCI-60中的57株癌細胞後， 發現其中只有不到1/10的細胞表達較高水準的GSDME， 這和之前文獻報導的GSDME的啟動子在癌細胞中會發生甲基化而表達沉默一致。

對於GSDME陽性的細胞， 如非小細胞肺腺癌細胞NCI-H522， 在用化療藥物處理後， 表現和SH-SY5Y類似， 發生GSDME依賴的細胞焦亡;同時， 將不表達GSDME的癌細胞用DNA甲基化酶抑制劑地西他濱(臨床用抗癌藥物)處理， 可以誘導GSDME表達， 同時也使得細胞對傳統化療藥物更敏感， 更易發生壞死。

和癌細胞不同， 很多正常細胞和組織有很高的GSDME表達。 研究人員在檢測了5株人源的正常原代細胞後， 發現其中3株高表達GSDME。 用化療藥物處理這些原代細胞後， GSDME陽性的細胞發生焦亡， 同時伴隨caspase-3依賴的GSDME切割;而不表達GSDME的細胞則發生凋亡。 在GSDME陽性細胞中用RNAi敲低GSDME表達後， 化療藥物引起的細胞焦亡則轉換為凋亡。 我們知道傳統化療藥物在臨床使用中會產生很大毒副作用，

限制了其抗癌效果。 而凋亡是一種“乾淨”的細胞死亡， 如果化療藥物只是誘發凋亡的話， 理論上不應產生很大的毒副作用。 考慮到癌細胞基本不表達GSDME， 而正常組織卻表達， 研究人員於是想到GSDME介導的焦亡很可能是化療藥物毒副作用的重要原因。 為了驗證這個想法， 他們製備了Gsdme缺失的小鼠。 當用化療藥物順鉑處理小鼠後， 正常小鼠的腸道、脾臟和肺部均發生嚴重損傷， 腸道和肺部也會有炎症反應、同時小鼠體重下降， 而這些組織損傷在Gsdme缺失小鼠上均可得到明顯緩解。 這些結果也在5-氟尿嘧啶引起的小鼠腸道損傷及博萊黴素引起的肺部炎症模型上也得到了進一步驗證。

該研究發現由Gasdermin家族蛋白GSDME介導的細胞焦亡很可能是傳統化療藥物產生毒副作用的重要原因， 為癌症治療提供了新思路，這也是首次展示細胞焦亡在天然免疫之外的生理病理過程中發揮重要功能;同時該研究成果還發現caspase-3也可以(通過活化GSDME)誘導細胞壞死(焦亡)，打破了caspase-3啟動必然導致細胞凋亡的經典概念。

原文連結：

原文摘要：

Pyroptosis, activated by the canonical caspase-1 inflammasomes or caspase-4/5/11 by cytosolic LPS, is critical for immunity. The caspases cleave Gasdermin D (GSDMD) in the middle linker to release autoinhibition on its Gasdermin-N domain that executes pyroptosis via the pore-forming activity. GSDMD belongs to a Gasdermin family sharing the pore-forming domain4,6,10. The function and mechanism of activation for other Gasdermins are unknown. Here we show that GSDME, originally identified as DFNA5 (Deafness, Autosomal Dominant 5), could switch TNFα or chemotherapy drugs-induced and caspase-3-mediated apoptosis to pyroptosis. GSDME was specifically cleaved by caspase-3 in the linker, generating a GSDME-N fragment that perforated membranes for pyroptosis induction. Following chemotherapy drugs treatment, caspase-3 cleavage of GSDME determined pyroptosis in certain GSDME-expressing cancer cells. GSDME was silenced in most cancer cells but expressed in many normal tissues. Human primary cells exhibited GSDME-dependent pyroptosis upon caspase-3 activation by chemotherapy drugs. Gsdme-/- mice were protected from chemotherapy drugs-induced various tissue damages and weight loss. These findings bring an unexpected concept that caspase-3 activation can trigger necrosis through cleaving GSDME and offer new insights into cancer chemotherapy.

為癌症治療提供了新思路，這也是首次展示細胞焦亡在天然免疫之外的生理病理過程中發揮重要功能;同時該研究成果還發現caspase-3也可以(通過活化GSDME)誘導細胞壞死(焦亡)，打破了caspase-3啟動必然導致細胞凋亡的經典概念。

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原文摘要：

Pyroptosis, activated by the canonical caspase-1 inflammasomes or caspase-4/5/11 by cytosolic LPS, is critical for immunity. The caspases cleave Gasdermin D (GSDMD) in the middle linker to release autoinhibition on its Gasdermin-N domain that executes pyroptosis via the pore-forming activity. GSDMD belongs to a Gasdermin family sharing the pore-forming domain4,6,10. The function and mechanism of activation for other Gasdermins are unknown. Here we show that GSDME, originally identified as DFNA5 (Deafness, Autosomal Dominant 5), could switch TNFα or chemotherapy drugs-induced and caspase-3-mediated apoptosis to pyroptosis. GSDME was specifically cleaved by caspase-3 in the linker, generating a GSDME-N fragment that perforated membranes for pyroptosis induction. Following chemotherapy drugs treatment, caspase-3 cleavage of GSDME determined pyroptosis in certain GSDME-expressing cancer cells. GSDME was silenced in most cancer cells but expressed in many normal tissues. Human primary cells exhibited GSDME-dependent pyroptosis upon caspase-3 activation by chemotherapy drugs. Gsdme-/- mice were protected from chemotherapy drugs-induced various tissue damages and weight loss. These findings bring an unexpected concept that caspase-3 activation can trigger necrosis through cleaving GSDME and offer new insights into cancer chemotherapy.