臺灣大學醫療器材研發中心副主任、組織工程與3D列印中心主任 徐善慧的《天然生物材料與應用於生物3D列印技術的研究》
丁建東：我們和上午一樣，
徐善慧：謝謝丁教授的介紹！很高興第二次參加這個論壇， 我目前在台大高分子研究所。
如果有人聽過我去年的演講的話， 其實來之前我一直在想一定要講到不一樣的東西， 不要讓大家重複聽到。 所以問了一下我要講什麼， 結果饒經理跟我說去年講合成，
我自己是做材料， 所以我會把重點放在生物3D列印和生物材料， 裡面有合成高分子材料和天然材料， 它們各有優缺點。 合成材料強度好， 沒有水性， 天然材料有水性， 但需要交流， 可能有毒性。 在去年8月27號的時候， 我曾經想過一個可以水性的合成材料， 大家看到我把“沒有辦法水性”這個特點， 我把它改過來， 寫成可以水性。 我做了6張片的片花， 給大家回顧一下。
我們用了PU的系統， 因為PCL diol， 我可以把它變成水性系統， 所以它的好處是水性， 不會融于水。 現在這台印表機， 已經完全使用太多年了。 好不容易弄出水性的性能， 大家可以看到它在低溫情況下是可以列印的。
當然剛剛的水性支架，
接下來還有什麼可以改善的呢？我們先看第一個改善方案。 早上危教授提過把材料變聰明， 讓它有形狀記憶。 因為它是PU是一個軟連接， 我們在置換這個軟連接以後， 我們可以讓它有形狀記憶， 一個捲曲的東西， 過一段時間可以水裡面恢復， 它在水裡面可以很快恢復。 另外我們還可以繼續改善它的軟內斷， 讓它可以穩固堆疊。 因為堆疊實在是一個很大的問題， 不過合成的材料， 因為它的強度比較高， 所以它堆疊幾層是沒有問題的。 第三個是什麼？從這裡我要開始切入今天的主題——天然高分子。 我們希望能夠借用天然高分子比較高的生物相容性， 以增強它的列印特性。 這是我們在天然裡面加一些大豆蛋白（SP）， 然後列印出來。下面這個圖是我做小角度的X光照射，可以看到如果是PU的話，你會看到一個HA，我們就發現大豆蛋白和PU之間有一些交互作用，會讓它產生扭曲結構，也讓它的列印變得更加容易。但是這裡有一個很大的問題，什麼樣的問題呢？雖然細胞在裡面加了大豆蛋白以後，因為它的生物會長得很好。其實今天這裡徐總也提到這種影響很重要。天然高分子有一個很大的好處，就是它的透明。可是合成高分子加上大豆以後，其實大家可以看到它是不透明的。雖然天然的組織是不透明的，但是這是一個很大的麻煩。所以這個細胞如果列印很厚，我還要找很久很久，不知道它到底是不是細胞，因為支架本身也會有一些外掛，所以眾裡尋他千百度，不知道那個細胞是不是細胞，所以天然生物材料是非常重要的。
接下來我就要進入今天的主題，就是天然生物材料、3D列印。
天然生物材料、3D列印有什麼好處呢？是天然構成，在過去多年的文獻裡面都有列印，這個列印就可以很好地區分生物相容性是否好。我自己在過去30年的研究裡面，其實天然高分子我做得不多，我只是把它拿來當做一個工具使用，因為我喜歡做合成。但是天然的高分子，我有一點點小小的經驗，我認為這個可以結合生物3D列印。就是什麼？列印單顆細胞，我希望能夠列印列印細胞群，一群的細胞。
我首先跟大家介紹一下，這是我們幾年前的發現，我們發現把介面幹細胞培養在殼聚糖或者殼聚糖酸感知的玻尿酸上面，這些細胞會自動組裝，然後細胞球。我們認為這個過程是模仿發育生物學，所以它除了可以讓幹性提升，幹性提升是所有全球的細胞都發生的。
我們這個成球跟別人的球有什麼不一樣？大家可以看到它是動態成球，它是先貼再拉，互相拉扯，然後再把它拉成球。所以我把這個過程取了一個名字，叫“CellAssembly”，就是拉來拉去，就是組裝成一個細胞球。
這個細胞球還有一個特點，就是因為它是拉來拉去拉成球的，所以跟其他成球方式不一樣，我們可以標定細胞，或者把我們要的的植體基因趁這個過程植入到裡面。因為我在這個球的時候做了一個實驗，就是我放了一個SHI、Foxd3，所以我覺得Foxd3很重要。其實我找文獻的時候找到中國有一個平教授，我就寫郵箱給他跟他要Foxd3，他就寄給我。然後我就做了一個實驗，發現這個球可以量身訂作，拿這個細胞，基於這個成球的過程，把Foxd3不轉進去以後，它就會變成類神經，我們可以在中樞神經裡面可以看到，它會讓斑馬魚的中樞神經受損，原來用酒精去把整個中樞神經破壞，但如果是這樣的一個細胞球的話，可以讓中樞神經功能恢復。
既然細胞球有這麼多的優勢，我們花很多時間去把這個平臺建立，讓我們再生醫學使用，那接下來，我這個題目是《天然生物材料的3D列印》，所以我們要回歸，我們用了哪些天然生物材料？第一個想到的是殼聚糖，因為殼聚糖可以讓細胞長得很好。所以我們就用幾滴糖融在醋酸裡面，然後用3D列印列印出來的支架，也發表在2012年。當然發表之後有一個問題，因為它是醋酸，沒有辦法高細胞列印。幸運的是在2013年，在一個年終會議的時候，有一位教授知道它裡面有一個殼聚糖的CF HYDROGNL，它這個CF HYDROGNL就是運用Gelatin，因為這個不需要酸溶，如果你直接讓它列印，它是會溶掉。這個時候他做了一個PEG，然後做成為了這個凝膠，我們在第一期工作裡面證明它可以促進神經的修復。在去年的時候，我們又進一步發現一件事情，我們把這個神經修復的效果水凝膠，發現殼聚糖並不能促進血管的再生。而且待會兒會證明殼聚糖會抑制癌症，所以它也能抑制細胞的再生。但是我們只加了一點點天然的Fibrinogen的東西，加了0.002%，加進去以後它就變成了新凝膠。這個膠，可以具有血管修復效果。但是可以看到，如果是正常的LG，它不會修復，如果是加一點凝膠，它的修復效果更高。它這個自修復很快，所以它是一顆一顆的。因為它自修復效果更好，所以它很快就變成了這樣，我們認為這是互穿網路造成的，我們也證明了這應該是互穿網路，因為我們用DFC去證明它的分化和變化。然後我們把剛剛加進去的順序變化了之後，它不會形成互穿，因為互穿網路要搭配形成，一個形成了這個網路，另外一個穿不進去。我們用這個機器證明它是互穿網路，造成了它更好的一些特性。我們也發現血管內的細胞在種到這個膠裡面，它就會成管狀的形態。我們進一步把它注射在斑馬魚，這個斑馬魚是一個基因改造的斑馬魚，它所有的血管都會有綠色的螢光。這個是一般的PDS打進去，這是正常的血管，在腹部這邊。如果打上水凝膠，會發現這些血管變少了。但是如果把新的這個加一點，打到斑馬魚的腹部，發現這邊有大量的血管。我們又進一步用了左下肢缺陷，就是把這個造成缺陷，就這樣打進去之後，就發現打CF HYDROGNL這一組，老鼠缺血的狀況改善了。
所以基於剛才的研究，我們認為殼聚糖這一類的東西，應該是一個好的生物3D列印材料。
我這邊用一個例子說明我們怎麼樣列印細胞球。剛剛的細胞球的好處是，它可以把N種細胞自組裝起來。自組裝的時候，會因為下面的基材有變化，造成各種不同層次的特性，這樣就可以模仿發佈生物學上細胞與細胞之間的交互作用。以左邊這個圖來看，可以看到以這個系統來說，缺氧區域移動，我們認為這會有利於外來血管的形成，這種形成全部是CULTURED，就是核核結構，然後神經幹細胞在外面、內皮細胞在裡面的細胞球。
接下來，我們用殼聚糖和這個Gelatin都進行了列印。這個Gelatin是我跟另外一位教授，這個彙報在我前面，有很多人用到。但是它這個要列印，需要一點技巧，因為它固定時間就會交融，你在交融之前就要把它列印出來。我們有試過，不管是Gelatin還是CF HYDROGNL，它都可以列印出來。當然如果要列印多層的話，我覺得它的穩定結構，是沒有像合成材料那麼好。
我們也把我們的細胞球跟它共列印之後，發現經過列印的細胞球，它的結構還在，並不會影響它的增生能力。
當然，在未來我們希望能夠做多細胞/多材料血管網路生物3D列印列印。剛才也提到沒有血管，它不可能長期生活。我們在今天也運用一個材料，這個材料都可以買到，它對糖類敏感，可以注射出小管。我們可以怎樣？我們可以在任何一個材料裡面，我們如果看原先的構想的話，這是哈佛傑尼夫畫的一個圖，他認為不同細胞列印，有些是要做成中空，中空的水凝膠裡面長血管。我們也可以用這種合成的方法，來讓膠裡面長出血管，這是我們在最近發表的，可以看到用對糖敏感的水凝膠，中空的CELL LNK就會形成，因為它對糖敏感，然後裡面就長出微血管。所以不管是合成或天然的，它都可能會長血管。如果是合成的話，就必須要把它列印出微小的管路，讓它可以長血管。
接下來給大家看一下神經幹細胞和內皮細胞的核殼結構的細胞球，放在Gelatin裡面去列印出來的結果，可以看到在長期培養之下，居然內皮細胞好像要伸出來，要長微血管。但是，因為所有天然材料作為一個球來講，所以這好像又要出來又不出來又要躲回去，然後Gelatin分解嗲之前，它還沒有長出來。所以，我們認為它有長血管的潛力，但是目前我們還沒有看到它的生長。這個是混球，這個是罵人的“混球”，它具有血管新生的潛能，因為它所有跟血管新生相關的基因導線都是增加的，在這個列印的細胞球裡面。
所以我們現在要回到原先的大問題了，就是合成材料好還是天然的材料好，也為我去年和今年的兩個不同的題材做一個小結。
因為我自己不是天然高分子的專家，所以這是我自己個人的意見。
所以一個生物3D列印墨水必須做到什麼？根據幾年的研究，我有個人一點點小小的淺見。剛剛雜七雜八跟大家分享了很多，所以我在這邊斗膽借用一千年前北宋哲學家張橫渠先生的名句，來跟大家講。第一，它必須在天底之間頂出一個穩固的3D空間。如果是用合成和天然材料和比的話，合成好像更勝一籌，因為它的Mechanical比較好。第二個條件是什麼？就是它必須要讓每一個細胞活得好好的，所以它必須要很好的生物相容性，這裡面牽涉到養分、氧氣的代謝，以這個層次來講的話，天然材料好像又更勝一籌。第三個條件是什麼？除了讓細胞存活，你必須要讓細胞在長期，當水凝膠分解之後它能夠存活，而且順利地工作。以剛剛來講，它必須要能夠做代謝。在這個層次來講的話，合成和天然很難說誰好，因為合成的高分子比較容易設計它的DEGRADATION。如果以growht來講，當然是天然比較好。所以這邊我要打一個問號；所以第四個就是要有血管網路，一定要開通四通五達的血管網路，才能讓這個列印出來的組織永遠存在那裡。我認為這個必須要借用合成和高分子的共同好處。
所以我簡單做一個小結。我認為在未來，我們可以通過天然高分子和合成高分子的結合，天然高分子有相容的好處，合成高分子有能堆疊的優點，然後我們可以運用細胞自組裝或者利用多種細胞的列印，Cell A、Cell B類比發育生物學的先進性，讓它們能夠結合起來。
相信通過這些多元元素的攜手合作，必定能夠共創生物3D列印的大未來，以造福人類，創造20年高品質的生活，70歲到90歲，謝謝！
然後列印出來。下面這個圖是我做小角度的X光照射，可以看到如果是PU的話，你會看到一個HA，我們就發現大豆蛋白和PU之間有一些交互作用，會讓它產生扭曲結構，也讓它的列印變得更加容易。但是這裡有一個很大的問題，什麼樣的問題呢？雖然細胞在裡面加了大豆蛋白以後，因為它的生物會長得很好。其實今天這裡徐總也提到這種影響很重要。天然高分子有一個很大的好處，就是它的透明。可是合成高分子加上大豆以後，其實大家可以看到它是不透明的。雖然天然的組織是不透明的，但是這是一個很大的麻煩。所以這個細胞如果列印很厚，我還要找很久很久，不知道它到底是不是細胞，因為支架本身也會有一些外掛，所以眾裡尋他千百度，不知道那個細胞是不是細胞，所以天然生物材料是非常重要的。接下來我就要進入今天的主題，就是天然生物材料、3D列印。
天然生物材料、3D列印有什麼好處呢？是天然構成，在過去多年的文獻裡面都有列印，這個列印就可以很好地區分生物相容性是否好。我自己在過去30年的研究裡面，其實天然高分子我做得不多，我只是把它拿來當做一個工具使用，因為我喜歡做合成。但是天然的高分子，我有一點點小小的經驗，我認為這個可以結合生物3D列印。就是什麼？列印單顆細胞，我希望能夠列印列印細胞群，一群的細胞。
我首先跟大家介紹一下，這是我們幾年前的發現，我們發現把介面幹細胞培養在殼聚糖或者殼聚糖酸感知的玻尿酸上面，這些細胞會自動組裝，然後細胞球。我們認為這個過程是模仿發育生物學，所以它除了可以讓幹性提升，幹性提升是所有全球的細胞都發生的。
我們這個成球跟別人的球有什麼不一樣？大家可以看到它是動態成球，它是先貼再拉，互相拉扯，然後再把它拉成球。所以我把這個過程取了一個名字，叫“CellAssembly”，就是拉來拉去，就是組裝成一個細胞球。
這個細胞球還有一個特點，就是因為它是拉來拉去拉成球的，所以跟其他成球方式不一樣，我們可以標定細胞，或者把我們要的的植體基因趁這個過程植入到裡面。因為我在這個球的時候做了一個實驗，就是我放了一個SHI、Foxd3，所以我覺得Foxd3很重要。其實我找文獻的時候找到中國有一個平教授，我就寫郵箱給他跟他要Foxd3，他就寄給我。然後我就做了一個實驗，發現這個球可以量身訂作，拿這個細胞，基於這個成球的過程，把Foxd3不轉進去以後，它就會變成類神經，我們可以在中樞神經裡面可以看到，它會讓斑馬魚的中樞神經受損，原來用酒精去把整個中樞神經破壞，但如果是這樣的一個細胞球的話，可以讓中樞神經功能恢復。
既然細胞球有這麼多的優勢，我們花很多時間去把這個平臺建立，讓我們再生醫學使用，那接下來，我這個題目是《天然生物材料的3D列印》，所以我們要回歸，我們用了哪些天然生物材料？第一個想到的是殼聚糖，因為殼聚糖可以讓細胞長得很好。所以我們就用幾滴糖融在醋酸裡面，然後用3D列印列印出來的支架，也發表在2012年。當然發表之後有一個問題，因為它是醋酸，沒有辦法高細胞列印。幸運的是在2013年，在一個年終會議的時候，有一位教授知道它裡面有一個殼聚糖的CF HYDROGNL，它這個CF HYDROGNL就是運用Gelatin，因為這個不需要酸溶，如果你直接讓它列印，它是會溶掉。這個時候他做了一個PEG，然後做成為了這個凝膠，我們在第一期工作裡面證明它可以促進神經的修復。在去年的時候，我們又進一步發現一件事情，我們把這個神經修復的效果水凝膠，發現殼聚糖並不能促進血管的再生。而且待會兒會證明殼聚糖會抑制癌症，所以它也能抑制細胞的再生。但是我們只加了一點點天然的Fibrinogen的東西，加了0.002%，加進去以後它就變成了新凝膠。這個膠，可以具有血管修復效果。但是可以看到，如果是正常的LG，它不會修復，如果是加一點凝膠，它的修復效果更高。它這個自修復很快，所以它是一顆一顆的。因為它自修復效果更好，所以它很快就變成了這樣，我們認為這是互穿網路造成的，我們也證明了這應該是互穿網路，因為我們用DFC去證明它的分化和變化。然後我們把剛剛加進去的順序變化了之後，它不會形成互穿，因為互穿網路要搭配形成，一個形成了這個網路，另外一個穿不進去。我們用這個機器證明它是互穿網路，造成了它更好的一些特性。我們也發現血管內的細胞在種到這個膠裡面，它就會成管狀的形態。我們進一步把它注射在斑馬魚，這個斑馬魚是一個基因改造的斑馬魚，它所有的血管都會有綠色的螢光。這個是一般的PDS打進去，這是正常的血管，在腹部這邊。如果打上水凝膠，會發現這些血管變少了。但是如果把新的這個加一點，打到斑馬魚的腹部，發現這邊有大量的血管。我們又進一步用了左下肢缺陷，就是把這個造成缺陷，就這樣打進去之後，就發現打CF HYDROGNL這一組，老鼠缺血的狀況改善了。
所以基於剛才的研究，我們認為殼聚糖這一類的東西，應該是一個好的生物3D列印材料。
我這邊用一個例子說明我們怎麼樣列印細胞球。剛剛的細胞球的好處是，它可以把N種細胞自組裝起來。自組裝的時候，會因為下面的基材有變化，造成各種不同層次的特性，這樣就可以模仿發佈生物學上細胞與細胞之間的交互作用。以左邊這個圖來看，可以看到以這個系統來說，缺氧區域移動，我們認為這會有利於外來血管的形成，這種形成全部是CULTURED，就是核核結構，然後神經幹細胞在外面、內皮細胞在裡面的細胞球。
接下來，我們用殼聚糖和這個Gelatin都進行了列印。這個Gelatin是我跟另外一位教授，這個彙報在我前面，有很多人用到。但是它這個要列印，需要一點技巧，因為它固定時間就會交融，你在交融之前就要把它列印出來。我們有試過，不管是Gelatin還是CF HYDROGNL，它都可以列印出來。當然如果要列印多層的話，我覺得它的穩定結構，是沒有像合成材料那麼好。
我們也把我們的細胞球跟它共列印之後，發現經過列印的細胞球，它的結構還在，並不會影響它的增生能力。
當然，在未來我們希望能夠做多細胞/多材料血管網路生物3D列印列印。剛才也提到沒有血管，它不可能長期生活。我們在今天也運用一個材料，這個材料都可以買到，它對糖類敏感，可以注射出小管。我們可以怎樣？我們可以在任何一個材料裡面，我們如果看原先的構想的話，這是哈佛傑尼夫畫的一個圖，他認為不同細胞列印，有些是要做成中空，中空的水凝膠裡面長血管。我們也可以用這種合成的方法，來讓膠裡面長出血管，這是我們在最近發表的，可以看到用對糖敏感的水凝膠，中空的CELL LNK就會形成，因為它對糖敏感，然後裡面就長出微血管。所以不管是合成或天然的，它都可能會長血管。如果是合成的話，就必須要把它列印出微小的管路，讓它可以長血管。
接下來給大家看一下神經幹細胞和內皮細胞的核殼結構的細胞球，放在Gelatin裡面去列印出來的結果，可以看到在長期培養之下，居然內皮細胞好像要伸出來，要長微血管。但是，因為所有天然材料作為一個球來講，所以這好像又要出來又不出來又要躲回去，然後Gelatin分解嗲之前，它還沒有長出來。所以，我們認為它有長血管的潛力，但是目前我們還沒有看到它的生長。這個是混球，這個是罵人的“混球”，它具有血管新生的潛能，因為它所有跟血管新生相關的基因導線都是增加的，在這個列印的細胞球裡面。
所以我們現在要回到原先的大問題了，就是合成材料好還是天然的材料好，也為我去年和今年的兩個不同的題材做一個小結。
因為我自己不是天然高分子的專家，所以這是我自己個人的意見。
所以一個生物3D列印墨水必須做到什麼？根據幾年的研究，我有個人一點點小小的淺見。剛剛雜七雜八跟大家分享了很多，所以我在這邊斗膽借用一千年前北宋哲學家張橫渠先生的名句，來跟大家講。第一，它必須在天底之間頂出一個穩固的3D空間。如果是用合成和天然材料和比的話，合成好像更勝一籌，因為它的Mechanical比較好。第二個條件是什麼？就是它必須要讓每一個細胞活得好好的，所以它必須要很好的生物相容性，這裡面牽涉到養分、氧氣的代謝，以這個層次來講的話，天然材料好像又更勝一籌。第三個條件是什麼？除了讓細胞存活，你必須要讓細胞在長期，當水凝膠分解之後它能夠存活，而且順利地工作。以剛剛來講，它必須要能夠做代謝。在這個層次來講的話，合成和天然很難說誰好，因為合成的高分子比較容易設計它的DEGRADATION。如果以growht來講，當然是天然比較好。所以這邊我要打一個問號；所以第四個就是要有血管網路，一定要開通四通五達的血管網路，才能讓這個列印出來的組織永遠存在那裡。我認為這個必須要借用合成和高分子的共同好處。
所以我簡單做一個小結。我認為在未來，我們可以通過天然高分子和合成高分子的結合，天然高分子有相容的好處，合成高分子有能堆疊的優點，然後我們可以運用細胞自組裝或者利用多種細胞的列印，Cell A、Cell B類比發育生物學的先進性，讓它們能夠結合起來。
相信通過這些多元元素的攜手合作，必定能夠共創生物3D列印的大未來，以造福人類，創造20年高品質的生活，70歲到90歲，謝謝！