牛角是牛科動物特有的， 用來防禦外界的攻擊， 但是在現代化養殖中容易造成人員傷亡， 通常， 舍飼牛場在犢牛出生一周之內，
“
基因編輯是怎麼做到這一點的呢， 先來瞭解這幾個問題：
牛角是怎麼形成的?
控制牛角發育的基因是什麼？
牛的無角、畸形角和正常牛角的基因有什麼不同？
”
1、 牛角的形成及發育
要培育無角牛， 首先要清楚牛角的形成及發育。 牛角屬於洞角， 由角質鞘和骨心組成， 其長度和強度在不同個體和品種中存在較大差異。 角質鞘是角最外層的結構，
通過對各個不同發育時期的胎兒角芽區和前額皮膚區進行組織學研究， 研究人員給出牛角的發育過程：
牛胎兒70 日齡時， 就出現了角芽區與前額皮膚區的分化， 角芽區真皮較厚， 角質細胞有液泡；
牛胎115 天時， 角芽區真皮組織中出現了加厚的神經束；
155 天時：出現皮脂腺
172 天：前額皮膚區出現
212 天時， 角芽區上皮基本分化完全
268 天時：前額皮膚區完全分化
與角芽區相比， 前額皮膚區一直沒有出現增厚的神經束， 只有正常的神經纖維。 對角芽區 115天出現的神經束進行神經特異性烯醇酶(NSE)染色， 發現其為 NSE 陽性， 證明角芽區較早的出現了神經組織。 而對無角胎兒的組織學分析顯示， 無角個體的角芽區相應位置和前額皮膚區的發育過程完全一致， 在各個時間點都不存在差異。
如圖 1所示， 早期階段(2～3個月) 角芽幾乎不可見， 很小， 淡黃色的斑點。 3～4個月時形成鋸齒狀， 隨後角芽在一個鋸齒狀區域可見， 但是沒有毛囊(5～6 個月)， 晚期階段(7～8 個月)角芽完全發育， 出現濃密毛囊， 會形成毛髮。
2、 牛無角及畸形角基因型分析
（1）無角
Lvica 和 Aurelie 等對無角歐洲牛和有角牛通過高密度 SNP 基因分型和高通量測序， 鑒定了引起牛無角表型的遺傳變異。 發現導致黑白花奶牛和非荷斯坦牛的無角突變是不同的。
隨後， Wiedemar 等對西門塔爾牛和荷斯坦牛的無角性狀進行了分析， 發現大多數西門塔爾牛無角突變是牛 1 號染色體1 706 054 後10 bp 處插入了208 bp(1 705 837～17 066 044)， 並伴隨其後 6 bp 的缺失;大多數荷斯坦牛的突變有 31 個 SNP、1 個 1 bp 的缺失、1個 5 bp 刪除伴隨 12 bp 插入和 1 個 80 kb 的基因組重複。 該重複是 80 128 bp(BTA1:1 909 352～1 989 480)， 並伴隨 2 bp 缺失。
Wiedemar 等鑒定出的 P C 和 P F 突變與 Lvica和 Aurelie的研究結果基本吻合， 但是 Wiedemar 等發現 PF 也存在於少數西門塔爾牛中， 而 P C 也存在於少數荷斯坦牛中;還發現有幾頭無角個體並不存在這兩種突變。 對大通犛牛無角性狀的突變研究發現，其無角突變同樣發生於 1 號染色體上，但是與黑白花牛和其他牛的關鍵區域並不重合。這些結果可能意味著，無角性狀基因還可能存在於其他位點且存在其他突變方式，還需要進一步研究。另外研究者發現，無角性狀只伴隨著不規則的睫毛 － 眼瞼表型，在一些無角突變群體中，存在純合突變雄性個體外陰缺陷症狀，但這一性狀並不完全與無角性狀相關，而僅存在於少數個體中。
（2）畸形角(scurs)
Scurs 是 2 型畸形角綜合征，是牛科動物中存在的一種角畸形症狀。患病個體角形態各異，但都不能發育成正常的角。雖然與正常角發生位置一樣，但是畸形角是直接與表皮相連，而不像有角牛那樣角與頭骨密切連接。畸形角在額骨上有山脊狀骨沉積，該沉積與角大小呈負相關;其骨中心沒有氣腔，且頭蓋骨和角的骨中心充滿軟組織，具體形態見圖 2。
Aurelien 等通過對 scurs 群體進行 SNP分析，發現引起該症狀的關鍵位點在牛 4 號染色體上 1．7 Mb 區域內，原因是 TWIST1 基因 1 號外顯子上的 10 bp 重複(148～157 bp)。該重複會導致移碼突變，使得TWIST1 基因的 2 個功能性結構域完全失活，從而導致該基因失活。進一步研究發現，患病個體基因型均為雜合，而正常個體均為野生純合型，證明該基因純合突變是致死的。Wiedemar 等證明雜合的無角牛在其 1 號染色體上同時 存 在1768587 C＞A 這一 SNP 時也會出現畸形角表型。
（3）無角和多系統綜合征(PMS)
無 角 和 多 系 統 綜 合 征是在研究一個夏洛萊公牛後代群體過程中發現的一種無角並伴隨著多種系統疾病的症狀。臨床症狀為:角完全發育不良、面部畸形、生長延緩、長期腹瀉、卵巢發育失敗以及神經和心臟異常。PMS 還有性別比例失調現象，雄性胎兒在妊娠期即死亡。通過全基因組測序發現其父本在 2 號染色體上存在一個 3．7Mb 的缺失，該缺失包含 AＲHGAP15、GTDC1 和ZEB2 基因，進一步研究發現 ZES2 基因缺失是造成無角多系統綜合征的主要原因。
3、 影響牛角發育相關基因
牛角發育是一個複雜的調控過程，其發育調控的具體機理還不清楚。根據有角、無角以及畸形角個體之間的基因表達差異，篩選到一些參與角發育過程的基因。其中 TWIST1 缺失會引起角畸形，所以 TWIST1 是參與角正常分化的關鍵基因。而引起牛無角和多系統綜合征的是 GTDC1、ZEB2 和 AＲHGAP15 基因的最後一個外顯子;qＲT-PCＲ 結構表明，這 3 個基因在 PMS個體中表達量均明顯下降，其中 ZES2 缺失是引起 PMS 的關鍵基因。TWIST1 和 ZES2 都是上皮向間質細胞轉化的關鍵因數，提示上皮向間質細胞轉化是角形成和發育的關鍵過程。
對無角和有角牛個體角芽區以及相應前額皮膚區基因表達差異的研究顯示，OLIG1、OLIG2、C1H21orf62、ＲXFP2 和 FOXL2 在無角和有角個體以及 角 芽 區 和 前 額 皮 膚 區 表 達 有 差 異，LOC100848215 在有角個體角芽區高表達，一個LincＲNA 在無角個體角芽區特異性高表達，證明這些基因參與角芽的發育與分化。
轉錄組分析表明，有角和無角個體差異基因參與的信號通路主要是細胞連接和上皮發育的相關通路，而無角和畸形角個體差異基因主要參與細胞外基質重建過程。在這些差異表達基因中，OLIG1、OLIG2 和 C1H21orf62 位於 1 號染色體上鑒定出的無角性狀區域內，而 ＲXFP2 和 FOXL2 被發現分別在瑞士綿羊和山羊無角性狀中起關鍵作用。
4、 通過基因編輯手段培育無角牛
Tan 等通過 Talen 技術，以牛 1 號染色體上重複 202 bp(1 705 843～1 706 045 bp )的無角安格斯牛這一區間序列為範本，得到了經基因編輯的荷斯坦牛胎兒成纖維陽性細胞。隨後通過體細胞核移植技術成功獲得了基因編輯無角荷斯坦奶牛。通過檢測，這些基因編輯牛都無角，且不存在其他症狀。這一研究證明，通過基因編輯手段將無角位點鑒定出的突變引入有角牛成纖維細胞中，可以得到無角個體，為無角牛的培育提供了方法。
5、基因編輯無角牛的未來展望
通過群體 SNP 分析及鑒定，發現無角性狀是一種由於基因突變導致的性狀。但是在不同品種牛中導致無角的突變是不同的，而且鑒定出的突變位點幾乎不存在已經注釋的基因，所以對於引起無角性狀的候選基因並不能確定。因此，還不能清楚的瞭解控制牛角生長發育的相關信號通路，還需要更多深入的研究來認識角的發育機制。
但是從發育過程進行分析可知，角是皮膚衍生物，是外胚層與中胚層相互作用形成的，其中伴隨著上皮和間充質細胞的相互誘導，以旁分泌誘導信號為主，所以研究者認為參與上皮和間充質細胞相互誘導的信號通路在角發生過程中起重要作用，包 括 Wnt 信 號 通 路、Notch 信 號 通 路、Hedgeheg 信號通路以及 BMP 信號通路。而無角性狀也一定與這些信號通路密切相關，在未來的研究中，可以深入研究無角個體中這些信號通路的變化情況，為牛角發育的信號通路研究提供更多思路。
隨著對無角性狀相關突變的研究進一步深入，可以通過基因編輯手段人工培育無角基因編輯牛。研究者已經將肉牛 P C 突變成功引入荷斯坦奶牛中獲得無角奶牛，那麼未來的研究也可以將奶牛 P F 的突變通過基因編輯手段引入肉牛乃至犛牛中生產無角牛。隨著研究的不斷深入，還可能在不同品種的牛中發現新的候選突變基因，這些新的突變也可以作為基因編輯範本培育不同類型的基因編輯牛。從這些發現的候選突變中選擇操作簡單，且突變個體除無角外完全正常的突變形式作為基因編輯範本，可以大批量培育無角個體，實現產業化養殖。
注：文章有改動，基因農業網編輯，原標題：《牛無角性狀研究進展》
作者：谷明娟 高 麗 王麗榮 李光鵬，內蒙古大學生命科學學院，哺乳動物生殖生物學與生物技術教育部重點實驗室
長按二維碼關注基因農業網
點擊“閱讀原文”~《牛無角性狀研究進展》，《生物技術進展》2017 年 第 7 卷 第 3 期 177～181
對大通犛牛無角性狀的突變研究發現，其無角突變同樣發生於 1 號染色體上，但是與黑白花牛和其他牛的關鍵區域並不重合。這些結果可能意味著，無角性狀基因還可能存在於其他位點且存在其他突變方式，還需要進一步研究。另外研究者發現，無角性狀只伴隨著不規則的睫毛 － 眼瞼表型，在一些無角突變群體中，存在純合突變雄性個體外陰缺陷症狀，但這一性狀並不完全與無角性狀相關，而僅存在於少數個體中。（2）畸形角(scurs)
Scurs 是 2 型畸形角綜合征，是牛科動物中存在的一種角畸形症狀。患病個體角形態各異，但都不能發育成正常的角。雖然與正常角發生位置一樣，但是畸形角是直接與表皮相連，而不像有角牛那樣角與頭骨密切連接。畸形角在額骨上有山脊狀骨沉積，該沉積與角大小呈負相關;其骨中心沒有氣腔，且頭蓋骨和角的骨中心充滿軟組織，具體形態見圖 2。
Aurelien 等通過對 scurs 群體進行 SNP分析，發現引起該症狀的關鍵位點在牛 4 號染色體上 1．7 Mb 區域內，原因是 TWIST1 基因 1 號外顯子上的 10 bp 重複(148～157 bp)。該重複會導致移碼突變，使得TWIST1 基因的 2 個功能性結構域完全失活，從而導致該基因失活。進一步研究發現，患病個體基因型均為雜合，而正常個體均為野生純合型，證明該基因純合突變是致死的。Wiedemar 等證明雜合的無角牛在其 1 號染色體上同時 存 在1768587 C＞A 這一 SNP 時也會出現畸形角表型。
（3）無角和多系統綜合征(PMS)
無 角 和 多 系 統 綜 合 征是在研究一個夏洛萊公牛後代群體過程中發現的一種無角並伴隨著多種系統疾病的症狀。臨床症狀為:角完全發育不良、面部畸形、生長延緩、長期腹瀉、卵巢發育失敗以及神經和心臟異常。PMS 還有性別比例失調現象，雄性胎兒在妊娠期即死亡。通過全基因組測序發現其父本在 2 號染色體上存在一個 3．7Mb 的缺失，該缺失包含 AＲHGAP15、GTDC1 和ZEB2 基因，進一步研究發現 ZES2 基因缺失是造成無角多系統綜合征的主要原因。
3、 影響牛角發育相關基因
牛角發育是一個複雜的調控過程，其發育調控的具體機理還不清楚。根據有角、無角以及畸形角個體之間的基因表達差異，篩選到一些參與角發育過程的基因。其中 TWIST1 缺失會引起角畸形，所以 TWIST1 是參與角正常分化的關鍵基因。而引起牛無角和多系統綜合征的是 GTDC1、ZEB2 和 AＲHGAP15 基因的最後一個外顯子;qＲT-PCＲ 結構表明，這 3 個基因在 PMS個體中表達量均明顯下降，其中 ZES2 缺失是引起 PMS 的關鍵基因。TWIST1 和 ZES2 都是上皮向間質細胞轉化的關鍵因數，提示上皮向間質細胞轉化是角形成和發育的關鍵過程。
對無角和有角牛個體角芽區以及相應前額皮膚區基因表達差異的研究顯示，OLIG1、OLIG2、C1H21orf62、ＲXFP2 和 FOXL2 在無角和有角個體以及 角 芽 區 和 前 額 皮 膚 區 表 達 有 差 異，LOC100848215 在有角個體角芽區高表達，一個LincＲNA 在無角個體角芽區特異性高表達，證明這些基因參與角芽的發育與分化。
轉錄組分析表明，有角和無角個體差異基因參與的信號通路主要是細胞連接和上皮發育的相關通路，而無角和畸形角個體差異基因主要參與細胞外基質重建過程。在這些差異表達基因中，OLIG1、OLIG2 和 C1H21orf62 位於 1 號染色體上鑒定出的無角性狀區域內，而 ＲXFP2 和 FOXL2 被發現分別在瑞士綿羊和山羊無角性狀中起關鍵作用。
4、 通過基因編輯手段培育無角牛
Tan 等通過 Talen 技術，以牛 1 號染色體上重複 202 bp(1 705 843～1 706 045 bp )的無角安格斯牛這一區間序列為範本，得到了經基因編輯的荷斯坦牛胎兒成纖維陽性細胞。隨後通過體細胞核移植技術成功獲得了基因編輯無角荷斯坦奶牛。通過檢測，這些基因編輯牛都無角，且不存在其他症狀。這一研究證明，通過基因編輯手段將無角位點鑒定出的突變引入有角牛成纖維細胞中，可以得到無角個體，為無角牛的培育提供了方法。
5、基因編輯無角牛的未來展望
通過群體 SNP 分析及鑒定，發現無角性狀是一種由於基因突變導致的性狀。但是在不同品種牛中導致無角的突變是不同的，而且鑒定出的突變位點幾乎不存在已經注釋的基因，所以對於引起無角性狀的候選基因並不能確定。因此，還不能清楚的瞭解控制牛角生長發育的相關信號通路，還需要更多深入的研究來認識角的發育機制。
但是從發育過程進行分析可知，角是皮膚衍生物，是外胚層與中胚層相互作用形成的，其中伴隨著上皮和間充質細胞的相互誘導，以旁分泌誘導信號為主，所以研究者認為參與上皮和間充質細胞相互誘導的信號通路在角發生過程中起重要作用，包 括 Wnt 信 號 通 路、Notch 信 號 通 路、Hedgeheg 信號通路以及 BMP 信號通路。而無角性狀也一定與這些信號通路密切相關，在未來的研究中，可以深入研究無角個體中這些信號通路的變化情況，為牛角發育的信號通路研究提供更多思路。
隨著對無角性狀相關突變的研究進一步深入，可以通過基因編輯手段人工培育無角基因編輯牛。研究者已經將肉牛 P C 突變成功引入荷斯坦奶牛中獲得無角奶牛，那麼未來的研究也可以將奶牛 P F 的突變通過基因編輯手段引入肉牛乃至犛牛中生產無角牛。隨著研究的不斷深入，還可能在不同品種的牛中發現新的候選突變基因，這些新的突變也可以作為基因編輯範本培育不同類型的基因編輯牛。從這些發現的候選突變中選擇操作簡單，且突變個體除無角外完全正常的突變形式作為基因編輯範本，可以大批量培育無角個體，實現產業化養殖。
注：文章有改動，基因農業網編輯，原標題：《牛無角性狀研究進展》
作者：谷明娟 高 麗 王麗榮 李光鵬，內蒙古大學生命科學學院，哺乳動物生殖生物學與生物技術教育部重點實驗室
長按二維碼關注基因農業網
點擊“閱讀原文”~《牛無角性狀研究進展》，《生物技術進展》2017 年 第 7 卷 第 3 期 177～181