先天免疫是抵禦入侵微生物的第一道防線。 最近研究表明lncRNA在調節DNA介導的先天免疫應答中也具有十分重要的作用。 可與HEXIM1等因數組裝成HDP-RNP從而參與先天免疫應答的調節。 相關研究結果線上發表在Molecular Cell上。
摘 要
DNA介導的先天免疫應答是抗微生物防禦和某些自身免疫性疾病的基礎。 作者使用免疫沉澱， 質譜分析和RNA測序來鑒定圍繞HEXIM1構建的核糖核酸複合物和稱之為HEXIM1-DNA-PK-paraspeckle組分-核糖核蛋白複合物（HDP-RNP）的長非編碼RNA NEAT1。 HDP-RNP包含DNA-PK亞基（DNAPKc， Ku70和Ku80）和paraspeckle蛋白（SFPQ， NONO， PSPC1， RBM14和 MATRIN3）。 HEXIM1與NEAT1的結合是複合物組裝所必需的。 通過cGAS-STING-IRF3途徑， 作者進一步證明HDP-RNP是外源DNA先天免疫應答所必需的。
重點
1、HEXIM1， NEAT1， DNA-PK和paraspeckle因數組裝成RNP複合物（HDP-RNP）
2、HDP-RNP調節cGAS-STING-IRF3途徑的DNA依賴性活化
3、HDP-RNP參與KSHV介導的先天免疫應答
4、ORF52靶向HDP-RNP以預防針對KSHV的先天免疫應答
實驗流程
1、HDP-RNP的鑒定：免疫沉澱、質譜分析、western blot
2、lncRNA NEAT1鑒定、功能分析及定位：RNA-seq、siRNA、Immuno-FISH
3、HDP-RNP調控先天免疫應答：免疫沉澱、RNA interference
4、ISD調控HDP-RNP的組裝和組成：免疫沉澱、Western blotting、RNA interference
5、ORF52靶向HDP-RNP以預防針對KSHV的先天免疫應答：siRNA、免疫沉澱
研究結果
1
HDP-RNP複合物的鑒定
HEXIM1是7SK snRNP/P-TEFb複合物的調節因數。
接下來的實驗表明， 這些蛋白可形成一個單一的RNP複合體， 獨立于7SK snRNP/P-TEFb複合物， 由HEXIM1， DNA-PK和paraspeckle組分所組成（圖1D）。
為了證實這種新的含多聚體HEXIM1的複合物的存在， 作者首先進行了FLAG-eHEXIM1免疫沉澱， western blot分析eHEXIM1相互作用蛋白的存在， eHEXIM1， CyclinT1， CDK9， LARP7和7SK RNA共同遷移， 峰強度在13和17之間（圖2A）。
接下來， 作者使用Reciprocal immunoprecipitation用於驗證蛋白質之間相互特異性結合， 結果顯示CDK9和HEXIM1在CyclinT1 IP中恢復， 而DNAPKc， Ku70， SFPQ和PSPC1則沒有（圖3B）。 CyclinT1的消耗導致CDK9的共消耗， 降低HEXIM1的水準， 但對DNAPKc， Ku70， SFPQ或PSPC1的水準沒有影響（圖3C）。 因此， CyclinT1不與DNAPKc，
對CyclinT1耗盡的提取物進行FLAG-eHEXIM1免疫沉澱， 並使用FLAG肽洗脫結合的物質， 將洗脫液再次進行免疫沉澱（reIP）顯示FLAG-eHEXIM1免疫沉澱Ku70， DNAPKc， PSPC1和SFPQ， 而不是CDK9（圖3B）。 DNA-PK組分Ku70免疫沉澱HEXIM1， DNAPKc， SFPQ和PSPC1；paraspeckle組分SFPQ免疫沉澱HEXIM1， Ku70， DNAPKc和PSPC1。 這些reIP實驗表明， HEXIM1， DNA-PK複合物， SFPQ和PSPC1在單個複合物中締合， 這與之前的HEXIM1/P-TEFb複合物無關。 因此， 作者推斷這個複合物為HDP-RNP。
作者接下來試圖確定涉及結合DNA-PK和paraspeckle亞基的HEXIM1相互作用域。使用HEXIM1缺失突變體和RNA結合突變體進行coIP實驗。將野生型（WT）和HEXIM1突變體轉染到HeLa細胞中， FLAG免疫沉澱全細胞提取物（WCE）。western blotting評估P-TEFb和HDP-RNP亞基的存在。HEXIM1 (1–180) 片段不與P-TEFb亞基相互作用，而181–359和150–359片段可以（圖4B）。HEXIM1 (181–359)不與HDP-RNP亞基相互作用，而HEXIM1(150–359)保留了與DNA-PK的相互作用，失去了與SFPQ和PSPC1的相互作用。因此，表明DNA-PK與HEXIM1氨基酸（aa）150-181結合，並且paraspeckle亞基結合對應於aa 1-150的區域。HEXIM1 ILAA RNA結合突變體不與P-TEFb或HDP-RNP亞基相互作用。該實驗顯示P-TEFb和HDP-RNP亞基結合HEXIM1的不同結構域（分別為N和C末端），並且HEXIM1是用於組裝HDP-RNP的平臺（圖4C）。
總之，這些實驗表明，HEXIM1形成兩個不同的RNP複合物，即7SK snRNP/P-TEFb複合體和7SK RNA非依賴性HDP-RNP。
2
lncRNA NEAT1鑒定、功能分析及定位
為了鑒定HDP-RNP組裝所需的RNA，作者進行了IP/reIP實驗來純化eHEXIM1-，無活性P-TEFb-和HDP-RNP結合的總的RNA。然後進行RNA-seq發現eHEXIM1 IP包含eHEXIM1/CyclinT1 （無活性P-TEFb）和eHEXIM1/Ku70（HDP-RNP）IP中所有RNA種類（圖5A）。7SK RNA是無活性P-TEFb IP中發現的主要RNA，但在HDP-RNP IP中沒有。相反，paraspeckles結構組分lncRNA NEAT1高度富集在HDP-RNP IP，在無活性P-TEFb IP中則沒有。7SK和NEAT1 RNAs高度存在eHEXIM1 IP，對照則不存在。並通過qRT-PCR驗證（圖5B）。
接下來，作者對FLAG純化的eHEXIM1的甘油梯度沉降收集的級分中的NEAT1進行了量化（圖6C）。NEAT1 RNA存在於收集的級分中，最大強度在6和12之間，遠離7SK RNA。NEAT1存在對應於HDP-RNP的級分中，並且不存在于7SK snRNP/P-TEFb複合物中，表明NEAT1是與HDP-RNP相關的RNA並且是其組裝所需的RNA。
為了驗證這一假說，作者分析了7SK和NEAT1 RNA敲降對無活性P-TEFb和HDP-RNP組裝的影響。敲降7SK RNA導致CyclinT1的減少，但並不影響HDP-RNP亞基與eHEXIM1的結合；相反，敲降NEAT1 RNA導致eHEXIM1 IP中HDP-RNP亞基的減少而不影響CyclinT1的結合（圖6D）。
總而言之，這些實驗表明，NEAT1是與HDP-RNP組裝相關並且需要的RNA，並且HEXIM1直接與NEAT1結合。相應地，作者發現，像SFPQ一樣，HEXIM1和Ku70都與paraspeckles標記NEAT1部分共定位（圖7E）。
3
HDP-RNP調控先天免疫應答
單純皰疹病毒感染可能會通過增強NEAT1的表達而導致過多的paraspeckles形成。因此，作者假設HDP-RNP在先天免疫應答中具有潛在作用。隨後分析了敲降HDP-RNP亞基對干擾素刺激DNA（ISD）和Poly（I：C）RNA啟動1型IFN的影響。對照siRNA轉染細胞（siSCR）中，ISD和Poly（I：C）RNA均誘導IFNα，IFNβ和IFN應答基因MXA（圖4A）。HDP-RNP亞基HEXIM1，Ku70，SFPQ和NEAT1的敲降導致ISD介導的IFNα，IFNβ和MXA誘導的喪失，但對Poly（I：C）誘導的應答沒有影響。這表明HDP-RNP在ISD介導的信號傳導中起作用。為了支持這一假設，HDP-RNP亞基的敲降會損害ISD介導的IRF3及其上游調節因數TBK1的磷酸化，而不影響其表達水準（圖8A）；對Poly（I：C）誘導的IRF3和TBK1的磷酸化沒有影響。這些實驗表明HDP-RNP作為DNA介導的IFN應答基因誘導上游IRF3和TBK1磷酸化的正調節因數。
DNA介導的cGAS感受器的啟動導致從ATP和GTP合成cGAMP。cGAMP結合並啟動下游適配器STING，引發啟動途徑導致產生1型IFN。為了探討HDP-RNP是否參與cGAMP的合成，作者分析了HDP-RNP敲降對cGAMP介導的IFN啟動的影響（圖9B）。HDP-RNP亞基的敲降使ISD和cGAMP介導的IFNβ mRNA表達和IRF3磷酸化的誘導均受損。因此，證明了HDP-RNP調控DNA介導的先天免疫應答上游IRF3和TBK1的磷酸化和下游cGAMP的合成。
4
ISD調控HDP-RNP的組裝和組成
HDP-RNP複合物作為ISD介導的先天免疫啟動的關鍵調節因數。為了深入瞭解HDP-RNP複合物的調節，作者提出ISD是否可以改造HDP-RNP的組成以及與導致IFN誘導的信號通路的相互作用。WCEs的免疫顯示，ISD處理對cGAS及其partner PQBP1，IRF3或RNA感受器RIG-1的表達水準沒有影響。但ISD增強STING的表達，誘導IRF3的磷酸化（圖10A）。雖然HDP-RNP亞基的水準不受ISD的影響，但是觀察到DNAPKc的活化，如絲氨酸2,056處的磷酸化增強。當eHEXIM1及其相關partner從mock或ISD處理的WCEs中純化時，發現Ku70和DNAPKc的組成型結合，但是ISD處理後損失了paraspeckle蛋白SFPQ和PSPC1。cGAS及其partner PQBP1，STING和IRF3在ISD處理後與eHEXIM1相關，這也導致STING被募集到HDP-RNP（圖10A）。總而言之，這些實驗不僅揭示了HEXIM1，cGAS，PQBP1，STING和IRF3之間的相互作用，而且還表明HEXIM1與其partner的相互作用通過ISD調節先天免疫啟動。
為了評估通過ISD的HEXIM1相互作用的重塑是否發生在HDP-RNP內，作者使用HEXIM1，KU70-或SFPQ特異性抗體對eHEXIM1結合蛋白進行了reIP。HEXIM1和Ku70的連續免疫沉澱保留了HEXIM1，Ku70，DNAPKc，cGAS，PQBP1和IRF3，而SFPQ和PSPC1在ISD處理時消失。SFPQ reIP顯示未用ISD處理時，HDP-RNP亞基cGAS，PQBP1，STING和IRF3均存在；ISD處理時則不存在（圖10A）。表明先天免疫啟動介質cGAS，PQBP1，STING和IRF3與HDP-RNP相互作用。
通過ISD觸發先天免疫應答導致HDP-RNP複合物的重塑和DNAPKc和IRF3的啟動。為了進一步描述HDP-RNP與先天免疫應答介質之間的相互作用，將cGAS從製備的WCEs免疫沉澱。通過Western blotting分析HDP-RNP亞基和PQBP1，STING和IRF3的存在（圖11B）。內源性cGAS免疫沉澱HDP-RNP複合物PQBP1，STING和IRF3。有趣的是，HEXIM1的敲降阻止HDP-RNP亞基與cGAS結合，雖然並不影響cGAS與PQBP1，STING和IRF3的相互作用，但是它消除了由ISD引起的cGAS結合的IRF3的磷酸化。表明HDP-RNP是IRF3磷酸化所必需的。敲降Ku70不影響HDP-RNP與cGAS，PQBP1或IRF3的結合（圖11C）。ISD處理KU70敲降的細胞導致SFPQ和PSPC1釋放，不影響HEXIM1、DNAPKc與cGAS、PQBP1和IRF3之間的相互作用，也不影響STING募集。然而，cGAS結合的DNAPKc和IRF3的磷酸化被消除。這些結果凸顯了HEXIM1作為先天免疫啟動途徑的HDP-RNP組裝平臺的作用以及Ku70是HDD-RNP中ISD誘導的DNAPKc和IRF3啟動所必需的。
5
HDP-RNP是介導先天免疫應答啟動所必需
接下來作者提出HDP-RNP是否涉及cGAS介導的針對DNA病毒的先天免疫應答。為此，使用卡波西肉瘤相關的皰疹病毒（KSHV）感染人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），其啟動cGAS-STING途徑。首先，使用特異性siRNA確認了HUVEC中ISD介導的IFNβ啟動需要HDP-RNP（圖12）。接下來，評估了KSHV在HUVECs中誘導先天免疫應答的能力。敲除HEXIM1，Ku70，NEAT1和STING導致KSHV介導的應答的抑制。為了避免cGAS和STING啟動（KSHV編碼的vIRF1可靶向STING並防止其磷酸化，編碼的LANA和ORF52可靶向cGAS並抑制其啟動）。因此，作者探討了ORF52表達對HDP-RNP與cGAS之間相互作用的影響。ORF52的表達不影響HEXIM1，cGAS，PQBP1和IRF3的表達水準（圖12C），但阻止了 ISD誘導的IRF3磷酸化。有趣的是，ORF52的表達導致cGAS和PQBP1與HEXIM1的結合喪失，對CyclinT1結合沒有影響。ORF52 IP恢復cGAS和PQBP1，但不是HEXIM1。總的來說，靶向HEXIM1-cGAS相互作用是一種病毒策略，可避免先天免疫應答的發生。
文 | 銳博生物
本文為作者授權Timedoo肽度發佈
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作者接下來試圖確定涉及結合DNA-PK和paraspeckle亞基的HEXIM1相互作用域。使用HEXIM1缺失突變體和RNA結合突變體進行coIP實驗。將野生型（WT）和HEXIM1突變體轉染到HeLa細胞中， FLAG免疫沉澱全細胞提取物（WCE）。western blotting評估P-TEFb和HDP-RNP亞基的存在。HEXIM1 (1–180) 片段不與P-TEFb亞基相互作用，而181–359和150–359片段可以（圖4B）。HEXIM1 (181–359)不與HDP-RNP亞基相互作用，而HEXIM1(150–359)保留了與DNA-PK的相互作用，失去了與SFPQ和PSPC1的相互作用。因此，表明DNA-PK與HEXIM1氨基酸（aa）150-181結合，並且paraspeckle亞基結合對應於aa 1-150的區域。HEXIM1 ILAA RNA結合突變體不與P-TEFb或HDP-RNP亞基相互作用。該實驗顯示P-TEFb和HDP-RNP亞基結合HEXIM1的不同結構域（分別為N和C末端），並且HEXIM1是用於組裝HDP-RNP的平臺（圖4C）。
總之，這些實驗表明，HEXIM1形成兩個不同的RNP複合物，即7SK snRNP/P-TEFb複合體和7SK RNA非依賴性HDP-RNP。
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為了鑒定HDP-RNP組裝所需的RNA，作者進行了IP/reIP實驗來純化eHEXIM1-，無活性P-TEFb-和HDP-RNP結合的總的RNA。然後進行RNA-seq發現eHEXIM1 IP包含eHEXIM1/CyclinT1 （無活性P-TEFb）和eHEXIM1/Ku70（HDP-RNP）IP中所有RNA種類（圖5A）。7SK RNA是無活性P-TEFb IP中發現的主要RNA，但在HDP-RNP IP中沒有。相反，paraspeckles結構組分lncRNA NEAT1高度富集在HDP-RNP IP，在無活性P-TEFb IP中則沒有。7SK和NEAT1 RNAs高度存在eHEXIM1 IP，對照則不存在。並通過qRT-PCR驗證（圖5B）。
接下來，作者對FLAG純化的eHEXIM1的甘油梯度沉降收集的級分中的NEAT1進行了量化（圖6C）。NEAT1 RNA存在於收集的級分中，最大強度在6和12之間，遠離7SK RNA。NEAT1存在對應於HDP-RNP的級分中，並且不存在于7SK snRNP/P-TEFb複合物中，表明NEAT1是與HDP-RNP相關的RNA並且是其組裝所需的RNA。
為了驗證這一假說，作者分析了7SK和NEAT1 RNA敲降對無活性P-TEFb和HDP-RNP組裝的影響。敲降7SK RNA導致CyclinT1的減少，但並不影響HDP-RNP亞基與eHEXIM1的結合；相反，敲降NEAT1 RNA導致eHEXIM1 IP中HDP-RNP亞基的減少而不影響CyclinT1的結合（圖6D）。
總而言之，這些實驗表明，NEAT1是與HDP-RNP組裝相關並且需要的RNA，並且HEXIM1直接與NEAT1結合。相應地，作者發現，像SFPQ一樣，HEXIM1和Ku70都與paraspeckles標記NEAT1部分共定位（圖7E）。
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HDP-RNP調控先天免疫應答
單純皰疹病毒感染可能會通過增強NEAT1的表達而導致過多的paraspeckles形成。因此，作者假設HDP-RNP在先天免疫應答中具有潛在作用。隨後分析了敲降HDP-RNP亞基對干擾素刺激DNA（ISD）和Poly（I：C）RNA啟動1型IFN的影響。對照siRNA轉染細胞（siSCR）中，ISD和Poly（I：C）RNA均誘導IFNα，IFNβ和IFN應答基因MXA（圖4A）。HDP-RNP亞基HEXIM1，Ku70，SFPQ和NEAT1的敲降導致ISD介導的IFNα，IFNβ和MXA誘導的喪失，但對Poly（I：C）誘導的應答沒有影響。這表明HDP-RNP在ISD介導的信號傳導中起作用。為了支持這一假設，HDP-RNP亞基的敲降會損害ISD介導的IRF3及其上游調節因數TBK1的磷酸化，而不影響其表達水準（圖8A）；對Poly（I：C）誘導的IRF3和TBK1的磷酸化沒有影響。這些實驗表明HDP-RNP作為DNA介導的IFN應答基因誘導上游IRF3和TBK1磷酸化的正調節因數。
DNA介導的cGAS感受器的啟動導致從ATP和GTP合成cGAMP。cGAMP結合並啟動下游適配器STING，引發啟動途徑導致產生1型IFN。為了探討HDP-RNP是否參與cGAMP的合成，作者分析了HDP-RNP敲降對cGAMP介導的IFN啟動的影響（圖9B）。HDP-RNP亞基的敲降使ISD和cGAMP介導的IFNβ mRNA表達和IRF3磷酸化的誘導均受損。因此，證明了HDP-RNP調控DNA介導的先天免疫應答上游IRF3和TBK1的磷酸化和下游cGAMP的合成。
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ISD調控HDP-RNP的組裝和組成
HDP-RNP複合物作為ISD介導的先天免疫啟動的關鍵調節因數。為了深入瞭解HDP-RNP複合物的調節，作者提出ISD是否可以改造HDP-RNP的組成以及與導致IFN誘導的信號通路的相互作用。WCEs的免疫顯示，ISD處理對cGAS及其partner PQBP1，IRF3或RNA感受器RIG-1的表達水準沒有影響。但ISD增強STING的表達，誘導IRF3的磷酸化（圖10A）。雖然HDP-RNP亞基的水準不受ISD的影響，但是觀察到DNAPKc的活化，如絲氨酸2,056處的磷酸化增強。當eHEXIM1及其相關partner從mock或ISD處理的WCEs中純化時，發現Ku70和DNAPKc的組成型結合，但是ISD處理後損失了paraspeckle蛋白SFPQ和PSPC1。cGAS及其partner PQBP1，STING和IRF3在ISD處理後與eHEXIM1相關，這也導致STING被募集到HDP-RNP（圖10A）。總而言之，這些實驗不僅揭示了HEXIM1，cGAS，PQBP1，STING和IRF3之間的相互作用，而且還表明HEXIM1與其partner的相互作用通過ISD調節先天免疫啟動。
為了評估通過ISD的HEXIM1相互作用的重塑是否發生在HDP-RNP內，作者使用HEXIM1，KU70-或SFPQ特異性抗體對eHEXIM1結合蛋白進行了reIP。HEXIM1和Ku70的連續免疫沉澱保留了HEXIM1，Ku70，DNAPKc，cGAS，PQBP1和IRF3，而SFPQ和PSPC1在ISD處理時消失。SFPQ reIP顯示未用ISD處理時，HDP-RNP亞基cGAS，PQBP1，STING和IRF3均存在；ISD處理時則不存在（圖10A）。表明先天免疫啟動介質cGAS，PQBP1，STING和IRF3與HDP-RNP相互作用。
通過ISD觸發先天免疫應答導致HDP-RNP複合物的重塑和DNAPKc和IRF3的啟動。為了進一步描述HDP-RNP與先天免疫應答介質之間的相互作用，將cGAS從製備的WCEs免疫沉澱。通過Western blotting分析HDP-RNP亞基和PQBP1，STING和IRF3的存在（圖11B）。內源性cGAS免疫沉澱HDP-RNP複合物PQBP1，STING和IRF3。有趣的是，HEXIM1的敲降阻止HDP-RNP亞基與cGAS結合，雖然並不影響cGAS與PQBP1，STING和IRF3的相互作用，但是它消除了由ISD引起的cGAS結合的IRF3的磷酸化。表明HDP-RNP是IRF3磷酸化所必需的。敲降Ku70不影響HDP-RNP與cGAS，PQBP1或IRF3的結合（圖11C）。ISD處理KU70敲降的細胞導致SFPQ和PSPC1釋放，不影響HEXIM1、DNAPKc與cGAS、PQBP1和IRF3之間的相互作用，也不影響STING募集。然而，cGAS結合的DNAPKc和IRF3的磷酸化被消除。這些結果凸顯了HEXIM1作為先天免疫啟動途徑的HDP-RNP組裝平臺的作用以及Ku70是HDD-RNP中ISD誘導的DNAPKc和IRF3啟動所必需的。
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HDP-RNP是介導先天免疫應答啟動所必需
接下來作者提出HDP-RNP是否涉及cGAS介導的針對DNA病毒的先天免疫應答。為此，使用卡波西肉瘤相關的皰疹病毒（KSHV）感染人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），其啟動cGAS-STING途徑。首先，使用特異性siRNA確認了HUVEC中ISD介導的IFNβ啟動需要HDP-RNP（圖12）。接下來，評估了KSHV在HUVECs中誘導先天免疫應答的能力。敲除HEXIM1，Ku70，NEAT1和STING導致KSHV介導的應答的抑制。為了避免cGAS和STING啟動（KSHV編碼的vIRF1可靶向STING並防止其磷酸化，編碼的LANA和ORF52可靶向cGAS並抑制其啟動）。因此，作者探討了ORF52表達對HDP-RNP與cGAS之間相互作用的影響。ORF52的表達不影響HEXIM1，cGAS，PQBP1和IRF3的表達水準（圖12C），但阻止了 ISD誘導的IRF3磷酸化。有趣的是，ORF52的表達導致cGAS和PQBP1與HEXIM1的結合喪失，對CyclinT1結合沒有影響。ORF52 IP恢復cGAS和PQBP1，但不是HEXIM1。總的來說，靶向HEXIM1-cGAS相互作用是一種病毒策略，可避免先天免疫應答的發生。
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