研究表明， miRNA在膀胱癌中異常表達， 對促進或抑制致癌， 發育， 凋亡， 侵襲和轉移具有多重影響。 circRNA可以充當“miRNA海綿”起作用， 對miRNA產生負調控作用。 然而， 作為“miRNA海綿”的circRNA的功能尚未在膀胱癌中明確闡明。 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院泌尿外科曾甫清課題組李亞偉博士近期發表在《EMBO reports》的研究提供了circRNAs可作為“miRNA海綿”的證據， 並提出了治療膀胱癌的新靶點。
摘 要
越來越多證據表明環狀RNA（circRNA）在調節基因表達方面發揮關鍵作用。 在本研究中， 作者進行RNA-seq並鑒定人類膀胱癌和正常膀胱組織中的6,154種不同的circRNA。 發現數百個circRNA在人膀胱癌組織中顯著失調。
概要
1、circHIPK3在人膀胱癌組織和細胞系中下調
2、circHIPK3有效地在膀胱癌細胞中充當miR-558海綿
3、circHIPK3通過靶向miR-558/乙醯肝素酶軸來抑制癌症侵襲和轉移
技術流程
1、膀胱癌組織和正常組織CircRNA表達譜：RNA-seq（銳博生物提供）
2、circHIPK3鑒定及定位：RT-PCR、Sanger測序、Northern blot分析、RNA螢光原位雜交（銳博生物提供）
3、circHIPK3體外功能驗證：circHIPK3表達載體轉染、細胞劃痕實驗、transwell遷移和侵襲實驗、siRNA
4、機制研究（circHIPK3充當miR-558海綿作用）：序列預測比對、miR-558/circHIPK3探針（銳博生物提供）、pull down、real-time PCR、miR-558 mimics、RNA FISH
5、miR-558體外功能驗證：miR-558 mimics、anti-miR-558 inhibitor、real-time PCR、Western blot、細胞劃痕與transwell實驗
6、circHIPK3與miR-558相互作用研究：共轉染實驗、transwell侵襲、細胞劃痕實驗
7、circHIPK3體內功能驗證：構建異種移植腫瘤（轉移）模型、免疫組織化學
研究結果
1
膀胱癌組織和正常組織CircRNA表達譜
首先， 作者通過RNA-seq鑒定circRNA。 發現人類膀胱癌和正常膀胱組織中的6,154個不同的circRNA， 其中有1,623個新的circRNA。 有88.35%的circRNAs來源於外顯子（圖1A）， 其他來源於內含子、基因間區域、3’UTR和5’UTR等。 膀胱癌組織中524個circRNAs顯著下調，
2
circHIPK3鑒定及定位
然後作者選擇了幾種顯著差異表達的circRNA來驗證其在膀胱癌細胞系中的存在。 RT-PCR分析發現circHIPK3在兩種細胞系中穩定表達。 circHIPK3（hsa_circ_0000284）來源於HIPK3基因， 由外顯子2（1,099bp）頭對尾剪接組成， 在膀胱癌組織中下調。 Sanger測序確認了circHIPK3頭對尾剪接及預期的大小（圖2C）。
然而， 頭對尾剪接可以通過反式剪接或基因組重排產生。 首先， 作者設計收斂引物和發散性引物分別擴增HIPK3 mRNA和circHIPK3。 發現circHIPK3僅能在cDNA中通過發散性引物擴增， 在gDNA中沒有擴增（圖3D）。 其次， Northern blot分析顯示circHIPK3有預期大小條帶。 與此同時， 檢測HIPK3轉錄本的環狀和線性形式發現RNase R可酶切線性的HIPK3片段而circHIPK3被保留， 通過RT-PCR進一步證實（圖3E,F）。
接下來，檢測circHIPK3在膀胱癌組織與正常組織中的表達水準發現，與正常組織相比，79.5%的膀胱癌組織中circHIPK3的表達顯著減少，分別與膀胱癌分級，侵襲和淋巴結轉移呈負相關（圖3G）。RNA螢光原位雜交表明circHIPK3主要位於細胞質（圖3I）。
3
circHIPK3體外功能驗證
為了探討circHIPK3在膀胱癌細胞中的功能，作者將circHIPK3表達載體轉染到T24T和UMUC3細胞。顯示circHIPK3的表達顯著增加，過表達的circHIPK3對RNase R處理具有抗性，可被RNase R降解的HIPK3 mRNA表達無明顯變化（圖4A）。細胞劃痕實驗表明circHIPK3過表達顯著抑制T24T和UMUC3細胞中的細胞遷移（圖4B）。transwell遷移和侵襲實驗顯示circHIPK3過表達也抑制膀胱癌細胞系的遷移和侵襲（圖4C,D）。
另一方面，作者將靶向circHIPK3連接位點的siRNA轉染到T24T和UMUC3細胞中，以評估對circHIPK3和HIPK3 mRNA表達的影響。發現這些siRNA顯著降低circHIPK3的表達，但對HIPK3 mRNA無影響（圖5E）。轉染最有效的circHIPK3 siRNA（si circHIPK3-1）後膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力增加（圖5F-H）。這些結果表明，circHIPK3過表達可以抑制膀胱癌細胞在體外的遷移和侵襲。
4
circHIPK3作用機制研究
為了確定circHIPK3是否能夠在膀胱癌細胞中充當miRNA海綿的作用，作者通過資料庫序列預測比對選擇了12個候選miRNAs（圖6A）。那麼circHIPK3是否可以直接結合這些候選miRNA？作者設計並驗證了生物素標記的circHIPK3探針在膀胱癌細胞系中可pull down circHIPK3，並且circHIPK3過表達穩定轉染子中的下拉效率顯著增強（圖6B,C）。提取pull down後的miRNA，real-time PCR檢測12個候選miRNA水準，顯示miR-558是唯一一個在T24T和UMUC3細胞中被circHIPK3大量pull down的（圖6D）。
CircHIPK3包含miR-558的6個預測結合位點。為了確認哪個結合位點是功能性的，作者在circHIPK3表達載體中突變了每個位點，以測試它是否仍然可以下拉miR-558。發現突變的circHIPK3也可以通過circHIPK3探針下拉（圖7E）。隨後，評估每個突變的circHIPK3下拉的miR-558的相對水準顯示突變位元點1或位點2後miR-558的相對結合顯著降低，而其他4個位點的突變未顯示出下降（圖7F）。這些結果表明，結合位點1和位點2而不是其他四個結合位點對於circHIPK3充當miR-558海綿是至關重要。
接下來應用生物素標記的miR-558 探針進一步驗證miR-558和circHIPK3的直接結合。real-time PCR檢測circHIPK3與miRNA mimics或突變體的結合。發現與破壞circHIPK3和miR-558之間堿基配對的突變體相比，在野生型miR-558的捕獲部分中circHIPK3的富集更高（圖8G）。RNA FISH測定顯示circHIPK3和miR-558共定位於細胞質中（圖8H）。上述結果表明，circHIPK3可以直接結合T24T和UMUC3細胞中的miR-558。
5
miR-558體外功能驗證
224個定義明確的膀胱癌病例的Kaplan-Meier生存曲線顯示，HPSE高表達患者的生存概率較差（圖9A）。real-time PCR發現與對照相比，miR-558在膀胱癌組織及T24T和UMUC3細胞中均上調（圖9B,C）。為了研究miR-558在膀胱癌細胞系中的功能，作者進行了miRNA的抑制和過表達實驗。細胞劃痕與transwell實驗顯示miR-558過表達顯著促進膀胱癌細胞的遷移和侵襲（圖9D）。通過用miR-558 mimics轉染的T24T和UMUC3細胞的預處理培養基處理HUVEC細胞，使得管形成能力也得到提高。相比之下，anti-miR-558 inhibitor的轉染顯著抑制T24T和UMUC3細胞遷移與侵襲，並抑制HUVEC細胞的管形成（圖9C,E,F）。Real-time PCR和Western blot實驗表明miR-558 mimics可增加膀胱癌細胞中HPSE，VEGF和MMP-9的表達，anti-miR-558 inhibitor則降低其表達（圖9G,H）。這些結果表明miR-558可以通過體外靶向HPSE來顯著促進膀胱癌的遷移，侵襲和血管生成。
6
circHIPK3與miR-558相互作用研究
為了確定circHIPK3是否通過與miR-558相互作用抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲，作者將miR-558 mimics和circHIPK3表達載體共轉染膀胱癌細胞。與單獨用miR-558 mimics轉染的細胞相比，共轉染的膀胱癌細胞中HPSE，MMP-9和VEGF的表達顯著降低（圖10A-D）。同時，transwell侵襲和細胞劃痕實驗表明，與miR-558 mimics轉染的細胞相比，共轉染的膀胱癌細胞顯示出侵襲和遷移能力的降低（圖10E,G）。此外，用miR-558 mimics和circHIPK3共轉染細胞的預處理培養基處理HUVEC細胞導致管形成能力也下調（圖10F）。這些資料表明circHIPK3通過充當miR-558海綿並且隨後抑制HPSE的表達來抑制細胞遷移，侵襲和血管生成。
7
circHIPK3體內功能驗證
進一步研究了circHIPK3強制表達對體內調節腫瘤生長，轉移和血管生成的影響。作者將circHIPK3表達載體或對照載體轉染的T24T細胞皮下注射到BALB/c裸鼠中。發現構建的異種移植腫瘤的生長速度和腫瘤重量降低（圖11A,B）。免疫組織化學顯示HPSE，MMP-9和VEGF的表達被過表達circHIPK3抑制。此外，導致CD31+微血管和平均腫瘤內血管密度減少（圖11C）。還通過尾靜脈注射構建轉移模型。結果顯示circHIPK3轉染裸鼠形成的肺轉移菌群比對照組少（圖11D）。這些結果表明，circHIPK3的強制表達有效地抑制膀胱癌體內生長，血管生成和轉移。
原文
Li Y, Zheng F, Xiao X, et al. CircHIPK3 sponges miR‐558 to suppress heparanase ex pression in bladder cancer cells[J]. EMBO reports, 2017: e201643581.
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通過RT-PCR進一步證實（圖3E,F）。接下來，檢測circHIPK3在膀胱癌組織與正常組織中的表達水準發現，與正常組織相比，79.5%的膀胱癌組織中circHIPK3的表達顯著減少，分別與膀胱癌分級，侵襲和淋巴結轉移呈負相關（圖3G）。RNA螢光原位雜交表明circHIPK3主要位於細胞質（圖3I）。
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circHIPK3體外功能驗證
為了探討circHIPK3在膀胱癌細胞中的功能，作者將circHIPK3表達載體轉染到T24T和UMUC3細胞。顯示circHIPK3的表達顯著增加，過表達的circHIPK3對RNase R處理具有抗性，可被RNase R降解的HIPK3 mRNA表達無明顯變化（圖4A）。細胞劃痕實驗表明circHIPK3過表達顯著抑制T24T和UMUC3細胞中的細胞遷移（圖4B）。transwell遷移和侵襲實驗顯示circHIPK3過表達也抑制膀胱癌細胞系的遷移和侵襲（圖4C,D）。
另一方面，作者將靶向circHIPK3連接位點的siRNA轉染到T24T和UMUC3細胞中，以評估對circHIPK3和HIPK3 mRNA表達的影響。發現這些siRNA顯著降低circHIPK3的表達，但對HIPK3 mRNA無影響（圖5E）。轉染最有效的circHIPK3 siRNA（si circHIPK3-1）後膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力增加（圖5F-H）。這些結果表明，circHIPK3過表達可以抑制膀胱癌細胞在體外的遷移和侵襲。
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circHIPK3作用機制研究
為了確定circHIPK3是否能夠在膀胱癌細胞中充當miRNA海綿的作用，作者通過資料庫序列預測比對選擇了12個候選miRNAs（圖6A）。那麼circHIPK3是否可以直接結合這些候選miRNA？作者設計並驗證了生物素標記的circHIPK3探針在膀胱癌細胞系中可pull down circHIPK3，並且circHIPK3過表達穩定轉染子中的下拉效率顯著增強（圖6B,C）。提取pull down後的miRNA，real-time PCR檢測12個候選miRNA水準，顯示miR-558是唯一一個在T24T和UMUC3細胞中被circHIPK3大量pull down的（圖6D）。
CircHIPK3包含miR-558的6個預測結合位點。為了確認哪個結合位點是功能性的，作者在circHIPK3表達載體中突變了每個位點，以測試它是否仍然可以下拉miR-558。發現突變的circHIPK3也可以通過circHIPK3探針下拉（圖7E）。隨後，評估每個突變的circHIPK3下拉的miR-558的相對水準顯示突變位元點1或位點2後miR-558的相對結合顯著降低，而其他4個位點的突變未顯示出下降（圖7F）。這些結果表明，結合位點1和位點2而不是其他四個結合位點對於circHIPK3充當miR-558海綿是至關重要。
接下來應用生物素標記的miR-558 探針進一步驗證miR-558和circHIPK3的直接結合。real-time PCR檢測circHIPK3與miRNA mimics或突變體的結合。發現與破壞circHIPK3和miR-558之間堿基配對的突變體相比，在野生型miR-558的捕獲部分中circHIPK3的富集更高（圖8G）。RNA FISH測定顯示circHIPK3和miR-558共定位於細胞質中（圖8H）。上述結果表明，circHIPK3可以直接結合T24T和UMUC3細胞中的miR-558。
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原文
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