清華大學結構生物學成果再發Nature文章

清華大學醫學院、結構生物學高精尖創新中心教授、千人計畫入選者布萊恩·克比爾卡 （Brian Kobilka）研究組在《自然》（Nature）期刊線上發表題為《利用X射線晶體結構揭示beta2腎上腺素受體胞內別構拮抗劑的工作機理》的文章 （Mechanism of intracellular allosteric β2AR antagonist reveled by X-ray crystal structure）， 首次報導了beta2腎上腺素受體同時結合正構拮抗劑卡拉洛爾（carazolol）與胞內別構拮抗劑Cmpd-15的複合物結構， 該成果對G蛋白偶聯受體別構調節物的研發具有指導意義。

beta2腎上腺素受體和Cmpd-15PA（即修飾後的cmpd-15）複合物的整體結構。 其中a是Cmpd-15PA的化學結構， b是Cmpd-15PA活性資料， c是Cmpd-15PA的電子密度（晶體學資料）， d-f展示了複合物的整體結構， 清楚表明Cmpd-15結合在beta2腎上腺素受體的胞內部分。

G蛋白偶聯受體是一類具有七次跨膜結構的膜蛋白受體。 這類受體可以感知包括氣味分子、激素、神經遞質、趨化因數等信號， 從而調節生理反應。 G蛋白偶聯受體是一類重要的藥物靶標， 大約30%的商業化藥物以G蛋白偶聯受體作為靶點。 由於對G蛋白偶聯受體結構和功能研究的傑出貢獻， 布萊恩·克比爾卡教授和羅伯特·萊夫科維茨教授分享了2012年的諾貝爾化學獎。

傳統上針對G蛋白偶聯受體的藥物研發工作主要以其正構底物結合位點（即天然底物結合位點）為靶點。 這類正構底物結合位點在不同亞型的G蛋白偶聯受體之間往往非常保守。 例如， 在人體中一共有九個腎上腺素受體， 它們都可以被腎上腺素啟動，

所以其正構底物結合位點十分相似。 這就導致研發出的藥物往往對不同亞型的特異性不夠， 造成藥物副作用。 別構調節物指的是不結合在G蛋白偶聯受體正構底物結合位點的小分子化合物。 其結合位置通常保守性較低， 因此有可能具有更好的特異性。 目前報導的G蛋白偶聯受體結構大多數都是結合了正構拮抗劑， 只有極少數結構裡面結合了別構調節物。 布萊恩·克比爾卡教授自從在清華大學建立實驗室以來， 一直保持和世界上不同實驗室合作， 共同研發G蛋白偶聯受體的別構調節物， 並利用結構生物學的方法研究別構調節物發揮功能的分子機理。

胞內別構拮抗劑第15號化合物（Cmpd-15）是羅伯特·萊夫科維茨研究組利用親和篩選的方式，

從DNA編碼的小分子化合物庫裡面鑒定出來的一個beta2腎上腺素受體別構拮抗劑 （Ahn, S. et al. 2017）。 生化實驗表明， 第15號化合物可能穿過細胞膜， 結合在beta2腎上腺素受體的胞內位置。 Beta腎上腺素受體的正構拮抗劑， 即乙型阻滯劑（beta-blocker）是一類極為重要的處方藥。 而Cmpd-15是第一個別構型的乙型阻滯劑， 其重要性不言而喻。

在這項工作中， Brian Kobilka研究組利用一個beta2腎上腺素受體和T4溶菌酶的融合蛋白（β2AR-T4L）進行晶體學研究。 研究初期利用T4溶菌酶的融合蛋白與Cmpd-15共結晶， 獲得了2.5埃的晶體資料。 但是由於胞內別構拮抗劑Cmpd-15溶解性很差， 在結晶條件中最高只能加到200uM。 在晶體資料裡雖然看到胞內部分有很弱的電子密度， 但是無法準確判斷其結合方式。

後來合作研究組對Cmpd-15進行了修飾， 在其上加入一個羧酸聚乙二醇基團以提高其溶解度。 改造後的小分子即為Cmpd-15PA。 布萊恩·克比爾卡研究組又獲得了T4溶菌酶的融合蛋白與Cmpd-15PA複合物2.7埃的晶體結構。 其晶體資料清楚地揭示了Cmpd-15的結合方式， 羧酸聚乙二醇基團在晶體中處於柔性不可見的狀態。 Cmpd-15結合在跨膜螺旋1、2、6、7的胞內端與胞內環1以及螺旋8形成的底物口袋。 結構分析、分子動態類比以及生化實驗結果表明， Cmpd-15通過兩種方式形成功能：一是通過穩定跨膜螺旋6， 將beta2腎上腺素受體穩定在非啟動狀態， 從而影響正構底物的親和力；二是直接與下游信號蛋白如G蛋白或者抑制蛋白 （arrestin）競爭， 干擾下游信號傳導。

beta2腎上腺素受體和Cmpd-15PA結合的細節。

值得注意的是， 2016年12月《自然》期刊曾經報導了兩個趨化因數受體CCR2和CCR9與各自胞內別構調節物的複合物結構（Zheng, Y. et al. 2016； Oswald, C. et al. 2016）。 儘管小分子的化學結構很不一樣， 和小分子相互作用的氨基酸序列也不保守， 但是本工作中腎上腺素能受體β2抗體 （β2AR）上的第十五化合物結合區域和趨化因數受體上的別構調節物結合區域在結構上很接近， 都是由跨膜螺旋1、2、6、7的胞內部分組成，這表明該位置可能在不同類型的G蛋白偶聯受體裡面都可以作為別構調節物結合口袋。因而，本工作對針對其他G蛋白偶聯受體的別構藥物研發工作具有指導意義。

本論文是布萊恩·克比爾卡教授與杜克大學羅伯特·萊夫科維茨教授、常州大學陳新教授以及斯坦福大學羅恩·德洛爾（Ron Dror）教授共同合作的成果。其中，布萊恩·克比爾卡教授實驗室負責結構生物學工作，羅伯特·萊夫科維茨教授實驗室負責生化實驗工作，陳新教授實驗室負責化學合成工作，羅恩·德洛爾教授實驗室負責分子動態類比工作。布萊恩·克比爾卡教授與羅伯特·萊夫科維茨教授為本文共同通訊作者。醫學院助理研究員劉翔宇博士與杜克大學佐恩科爾·安（Seungkirl Ahn）博士為本文的共同第一作者。本課題得到北京市結構生物學高精尖創新中心的資助。衍射資料收集得到日本Spring-8同步輻射光源的支援和協助。

原文標題：

Mechanism of intracellular allosteric β2AR antagonist reveled by X-ray crystal structure

都是由跨膜螺旋1、2、6、7的胞內部分組成，這表明該位置可能在不同類型的G蛋白偶聯受體裡面都可以作為別構調節物結合口袋。因而，本工作對針對其他G蛋白偶聯受體的別構藥物研發工作具有指導意義。

本論文是布萊恩·克比爾卡教授與杜克大學羅伯特·萊夫科維茨教授、常州大學陳新教授以及斯坦福大學羅恩·德洛爾（Ron Dror）教授共同合作的成果。其中，布萊恩·克比爾卡教授實驗室負責結構生物學工作，羅伯特·萊夫科維茨教授實驗室負責生化實驗工作，陳新教授實驗室負責化學合成工作，羅恩·德洛爾教授實驗室負責分子動態類比工作。布萊恩·克比爾卡教授與羅伯特·萊夫科維茨教授為本文共同通訊作者。醫學院助理研究員劉翔宇博士與杜克大學佐恩科爾·安（Seungkirl Ahn）博士為本文的共同第一作者。本課題得到北京市結構生物學高精尖創新中心的資助。衍射資料收集得到日本Spring-8同步輻射光源的支援和協助。

原文標題：

Mechanism of intracellular allosteric β2AR antagonist reveled by X-ray crystal structure