作者：米粒兒
克羅恩病是一種原因不明的腸道炎症性疾病， 今天跟大家分享的這篇論文主要關注克羅恩病。 揭示缺氧環境對腸道炎症保護的分子機制。
缺氧可顯著性的降低腫瘤致死因數α， 白介素-6和NLRP3表達， 並且提高自噬蛋白p62翻轉。 在體外， 缺氧引發的自噬降低NF-κB和NLRP3的表達。 同時， 作者也證明NLRP3可作為mTOR的結合蛋白。
二甲基草醯甘氨酸 調節的羥化酶抑制可改善小鼠結膜炎， 下調NLRP3， 促進自噬。 因此可發現， 缺氧通過降低mTOR和 NLRP3的結合以及啟動自噬減輕炎症。
下邊我們看一下作者是如何得到這些結論的。
1
缺氧降低克羅恩病人體內炎症相關基因表達
為了研究缺氧環境對結腸炎症的影響， 作者模擬了海拔4000m的缺氧環境， 並將正常人和炎性腸疾病患者暴露于以上缺氧環境3h後。 結果顯示克羅恩病患者體內NLRP3和TNFα表達量明顯升高， 而IL-1β和IL-6的mRNA水準並未見顯著變化。 而潰瘍性結腸炎患者中未見此效應（Fig.1a-d）。
缺氧處理後（1周/2周）後， NLRP3， TNFα和IL-6的mRNA水準顯著降低。 而且缺氧造成的炎症相關因數降低現象與自噬相關p62表達升高同時發生（Fig.1e）。
2
缺氧可降低葡聚糖硫酸鈉誘導的炎症基因表達
為了進一步驗證缺氧環境對炎症影響和NLRP3在缺氧調節中的作用， WT和NLRP3-/-小鼠經2%葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理後， 暴露于常氧或者缺氧環境18h。
而經缺氧處理後， TNFα， IL-6， IL-1β， NLRP3的mRNA水準在WT小鼠中顯著降低， 而在NLRP3-/-小鼠中未見明顯改變。 該結果證明， NLRP3在缺氧調節的抑制作用中發揮重要作用。 同時， 缺氧也可誘導WT和NLRP3-/-小鼠中自噬相關蛋白p62和LC3的表達（Fig.2f-g）。
採用缺氧marker VEGF的表達來確認實驗中的缺氧環境。 在常氧環境中， DSS處理的小鼠中， NF-κB 亞基p65/RelA磷酸化水準與p62表達量同時提高（Fig.2h）。 在WT小鼠中， 缺氧能夠逆轉DSS誘導的p65//RelA磷酸化和NLRP3表達。
並且可以降低mTOR磷酸化水準， p62的降解， 增加LC3-II/LC3-I， 從而修復細胞自噬（Fig.2h）。 有意思的是， NLRP3-/-小鼠中， mTOR磷酸化水準降低， 並且對缺氧環境無回應， 說明NLRP3在自噬調控中的作用。
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在IL-10-/-小鼠中缺氧導致炎症基因表達降低
接下來， 我們試圖確認在小鼠直腸炎模型IL-10-/-中確認缺氧對抗炎症效應的影響， WT， IL-10-/-， Nlrp3-/-和IL-10-/-/Nlrp3-/-雙敲除的小鼠模型分別暴露于常氧/缺氧環境中18h。 在常氧環境中， IL-10-/-小鼠中TNFα, IL-6, IL1β 和 Nlrp3的mRNA水準表達上升， 而在缺氧環境中表達下降， 同時p62表達也上升（Fig3a-f）。 缺氧環境中LC3的mRNA水準也上升（Fig3g）。
在常氧環境中， 與lrp3-/-和IL-10-/-/Nlrp3-/-雙敲除的小鼠模型相比，IL-10-/-小鼠中，p65/RelA磷酸化，mTOR磷酸化，p62和LC3的水準都有所上升（Fig3h）。這一結果提示
4
在IECs中，缺氧導致NLRP3降解和自噬啟動
接下來，作者試圖揭示缺氧對結腸粘膜的保護機制。首先，作者將IEC細胞系HT-29暴露於缺氧狀態，同時設置LPS暴露組和非暴露組。HIF-1α在缺氧後6h含量達到最高。
NF-κB 亞基p65/RelA磷酸化持續啟動，且NF-κB上游抑制因數IκBα表達也被逆轉，自噬也啟動。同時，缺氧導致LPS誘導的NLRP3表達降低（Fig. 4a）和p62 mRNA表達升高。
同樣的，缺氧導致NLRP3 mRNA在6和18h暫態表達升高（Fig.4c）。NLRP3蛋白水準在蛋白酶體抑制劑MG132存在時表達量也下降，表明缺氧導致的NLRP3水準降低並非通過蛋白酶體機制（Fig.4e）。
有意思的是，在蛋白酶體抑制劑存在的情況下，缺氧可逆轉泛素化蛋白積累，表明缺氧環境下，替代蛋白降解機制例如自噬被啟動（Fig.4e）。
在獲得了缺氧調節p62和NLRP3後，作者試圖揭示p62和NLRP3的轉錄調節分子機制。通過p62啟動子的序列分析獲得了HIF-1α 和p65/RelA可能的結合位點（Fig.4f）。如圖Fig.4g所示，p65/RelA的結合位點為NLRP3啟動子的-468位點，HIF-1α的結合位點為NLRP3啟動子的-150位點。
作者採用ChIP實驗研究轉錄因數與p62和NLRP3啟動因數的結合活性。ChIP實驗結果顯示缺氧處理6h後，HIF-1α與p62啟動子的結合能力增強，說明HIF-1α在缺氧條件下可誘導p62表達（Fig.4f）。而NF-κB 與p62啟動子結合能力基本不變（Fig.4g）。
相反的，由於在未缺氧處理細胞中NLRP3並沒有持續性表達，因此，作者觀察到NF-κB 與NLRP3啟動子持續性結合。但是儘管在缺氧過程中HIF-1α含量增加，但是HIF-1α在NLRP3啟動子上並沒有富集。
5
在IECs中，缺氧通過抑制NF-κB通路調節自噬
在HT-29細胞中，溶酶體的生物合成和積累可採用LysoTracker Yellow-HCK-123檢測。缺氧可誘導溶酶體的積累，更進一步證明在低氧水準下自噬啟動。Fig.5a檢測線粒體活化水準。
為了探討缺氧調節自噬和炎症保護之間的因果關係，在氯喹（自噬晚期抑制劑，阻止帶有溶酶體的自噬體溶解）存在情況下，HT-29細胞暴露於缺氧環境。缺氧24h後，自噬啟動 (Fig. 5b)，缺氧引起的p62降解關閉，p65/RelA磷酸化水準下降也非觀察到（Fig. 5c）. 這些結果表明缺氧引發的自噬對下游促炎信號通路非常重要。相反的，缺氧仍然可以降低NLRP3蛋白表達 (Fig. 5c), 表明自噬並不調節NLRP3降解。
6
缺氧降低NLRP3與mTOR的靶向結合
接下來，作者試圖探討NLRP3在自噬調節中的作用。作者在HT-29細胞中轉染NLRP3-特異性siRNA，敲除NLRP3之後，mTOR磷酸化水準降低，基礎自噬水準升高(Fig. 6a), 表明NLRP3通過促進mTOR 磷酸化持續性抑制細胞自噬。而且，Co-IP實驗也證明NLRP3是mTOR直接作用靶點，而在缺氧環境下這一直接作用被抑制 (Fig. 6b)。
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DMOG 減輕DSS引發的結腸炎，降低NLRP3表達，促進自噬
為了研究HIF-1α穩定性對缺氧調節的抗炎效應的影響，WT小鼠暴露於2% DSS和羥化酶抑制劑DMOG。DMOG通過模擬缺氧環境抑制羥化酶活性啟動HIF通路，可引起HIF-1α穩定和反式啟動。DMOG和DSS同時處理的小鼠結腸炎病情得到明顯緩解(Fig. 7a-7e)。
DMOG可降低DSS誘導的TNF-α，IL-6，IL-1β 和NLRP3 mRNA水準(Fig. 7g–j),並且增加自噬蛋白p62表達(Fig. 7l)，LC3表達也升高（Fig.7m）。在蛋白水準，DMOG處理的小鼠NF-κB 磷酸化和NLRP3水準降低，並且啟動自噬 (Fig. 7n)。
參考文獻：Hypoxia ameliorates intestinal inflammation through NLRP3/mTOR downregulation and autophagy activation
與lrp3-/-和IL-10-/-/Nlrp3-/-雙敲除的小鼠模型相比，IL-10-/-小鼠中，p65/RelA磷酸化，mTOR磷酸化，p62和LC3的水準都有所上升（Fig3h）。這一結果提示4
在IECs中，缺氧導致NLRP3降解和自噬啟動
接下來，作者試圖揭示缺氧對結腸粘膜的保護機制。首先，作者將IEC細胞系HT-29暴露於缺氧狀態，同時設置LPS暴露組和非暴露組。HIF-1α在缺氧後6h含量達到最高。
NF-κB 亞基p65/RelA磷酸化持續啟動，且NF-κB上游抑制因數IκBα表達也被逆轉，自噬也啟動。同時，缺氧導致LPS誘導的NLRP3表達降低（Fig. 4a）和p62 mRNA表達升高。
同樣的，缺氧導致NLRP3 mRNA在6和18h暫態表達升高（Fig.4c）。NLRP3蛋白水準在蛋白酶體抑制劑MG132存在時表達量也下降，表明缺氧導致的NLRP3水準降低並非通過蛋白酶體機制（Fig.4e）。
有意思的是，在蛋白酶體抑制劑存在的情況下，缺氧可逆轉泛素化蛋白積累，表明缺氧環境下，替代蛋白降解機制例如自噬被啟動（Fig.4e）。
在獲得了缺氧調節p62和NLRP3後，作者試圖揭示p62和NLRP3的轉錄調節分子機制。通過p62啟動子的序列分析獲得了HIF-1α 和p65/RelA可能的結合位點（Fig.4f）。如圖Fig.4g所示，p65/RelA的結合位點為NLRP3啟動子的-468位點，HIF-1α的結合位點為NLRP3啟動子的-150位點。
作者採用ChIP實驗研究轉錄因數與p62和NLRP3啟動因數的結合活性。ChIP實驗結果顯示缺氧處理6h後，HIF-1α與p62啟動子的結合能力增強，說明HIF-1α在缺氧條件下可誘導p62表達（Fig.4f）。而NF-κB 與p62啟動子結合能力基本不變（Fig.4g）。
相反的，由於在未缺氧處理細胞中NLRP3並沒有持續性表達，因此，作者觀察到NF-κB 與NLRP3啟動子持續性結合。但是儘管在缺氧過程中HIF-1α含量增加，但是HIF-1α在NLRP3啟動子上並沒有富集。
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在IECs中，缺氧通過抑制NF-κB通路調節自噬
在HT-29細胞中，溶酶體的生物合成和積累可採用LysoTracker Yellow-HCK-123檢測。缺氧可誘導溶酶體的積累，更進一步證明在低氧水準下自噬啟動。Fig.5a檢測線粒體活化水準。
為了探討缺氧調節自噬和炎症保護之間的因果關係，在氯喹（自噬晚期抑制劑，阻止帶有溶酶體的自噬體溶解）存在情況下，HT-29細胞暴露於缺氧環境。缺氧24h後，自噬啟動 (Fig. 5b)，缺氧引起的p62降解關閉，p65/RelA磷酸化水準下降也非觀察到（Fig. 5c）. 這些結果表明缺氧引發的自噬對下游促炎信號通路非常重要。相反的，缺氧仍然可以降低NLRP3蛋白表達 (Fig. 5c), 表明自噬並不調節NLRP3降解。
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缺氧降低NLRP3與mTOR的靶向結合
接下來，作者試圖探討NLRP3在自噬調節中的作用。作者在HT-29細胞中轉染NLRP3-特異性siRNA，敲除NLRP3之後，mTOR磷酸化水準降低，基礎自噬水準升高(Fig. 6a), 表明NLRP3通過促進mTOR 磷酸化持續性抑制細胞自噬。而且，Co-IP實驗也證明NLRP3是mTOR直接作用靶點，而在缺氧環境下這一直接作用被抑制 (Fig. 6b)。
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DMOG 減輕DSS引發的結腸炎，降低NLRP3表達，促進自噬
為了研究HIF-1α穩定性對缺氧調節的抗炎效應的影響，WT小鼠暴露於2% DSS和羥化酶抑制劑DMOG。DMOG通過模擬缺氧環境抑制羥化酶活性啟動HIF通路，可引起HIF-1α穩定和反式啟動。DMOG和DSS同時處理的小鼠結腸炎病情得到明顯緩解(Fig. 7a-7e)。
DMOG可降低DSS誘導的TNF-α，IL-6，IL-1β 和NLRP3 mRNA水準(Fig. 7g–j),並且增加自噬蛋白p62表達(Fig. 7l)，LC3表達也升高（Fig.7m）。在蛋白水準，DMOG處理的小鼠NF-κB 磷酸化和NLRP3水準降低，並且啟動自噬 (Fig. 7n)。
參考文獻：Hypoxia ameliorates intestinal inflammation through NLRP3/mTOR downregulation and autophagy activation