心肌肌鈣蛋白：分子的許多驚訝

馮仁豐

單克隆抗體是檢測心肌肌鈣蛋白T和I（相應的是cTnT和cTnI）的免疫檢測基礎， 第一次報告是在約25年前。 希望它們對急性心肌梗死（AMI）有更準確的診斷， 因為改善了組織特異性。

在開始臨床試驗後， 很快地認識到心肌特異性的優點；沒有預料到在沒有傳統的AMI診斷指標的患者中， 發生了“太早”升高的cTnT和cTnI；被初始相信理解為生物標誌物的診斷特異性。 進一步的臨床研究確定了這些發現的真實原因：很小的心肌傷害。 這些新的發現， 使得cTn檢測導致對心肌梗死的重新定義， 最後為急性冠脈綜合征（ACS）的新的臨床診斷分類。

在新的診斷範例中， AMI是ACS的一個亞組， 二者情況可由cTnT和cTnI升高是否高於預先決定的判斷限值給出診斷。 缺血性心肌損害診斷的未來演變， 已經確認了7個類型的AMI， 這在早期使用肌鈣蛋白是沒有預料的發展。

除了cTnI證實的心肌組織特異性和第二代cTnT檢測改善的特異性外， 生物標誌物濃度的上升已經被發現在非缺血的心肌疾病， 如腎衰和心衰， 在心臟中毒的藥物給予後、和在敗血症和中風下。 研究這些升高的原因， 揭示了非缺血性心肌壞死作為cTn從損害的心肌細胞內釋放的原因。 它也已經被通過風險分層評估的過程確定， 這些升高， 無論是缺血性的還是非缺血性的， 預示了更糟的臨床後果， 即使cTn濃度沒有超過你預先設定的診斷判斷限值。

但與cTn的診斷角色相反， 風險分層評估是一個統計過程， 依據cTn和其他風險標誌物濃度， 證實一組患者和指定一個臨床結果的某些可能性。

在引入到臨床實踐時， cTn檢測被預期可簡化AMI的診斷， 但是它看來， 它是臨床診斷的一個打開的潘多（Pandora）拉魔盒。 儘管cTn使得診斷AMI在消除了因非特異原因的複雜性後有點簡單， 但準確解釋cTn濃度依然要求臨床專家和實驗室的專家。 進一步複雜化了這個狀態現狀是， 在臨床實踐中遇到了未預期的cTn結果時， 必須考慮一系列分析變異。

其他的如cTnT mRNA 的拼接、cTnT和cTnI二者轉譯後修飾的各個形式、迴圈的cTnT、cTnI和肌鈣蛋白C（TnC）的單體、雙聚體、或三聚體；cTnI的生理的磷酸化作用等， 均已經在文獻中報告，

作為cTn結果和臨床表現間不符的原因。 迴圈抗-cTn自身抗體、封閉檢測抗體的結合、和人抗鼠抗體（HAMA）等， 會在肌鈣蛋白檢測中出現外加的分析干擾， 導致假陰性和假陽性的肌鈣蛋白結果。

2017年6月美國臨床化學雜誌上Katrukha等， 研究了cTnT轉譯後修飾的另一種形式， 是被凝血酶蛋白水解的降解， 一個絲氨酸蛋白水解酶凝聚因數， 會在缺血組織壞死處作用、或存在於收集血液後的人血清內。 作者提供了通過凝血酶對cTnT蛋白水解的實驗證據， 可以在體外改變cTnT氨基酸序列。 他們展現了在活躍的凝血酶存在下， cTnT分子的縮短；但可以被特定的凝血酶抑制劑封閉。

使用質譜分析， 他們證實了一個29-kDa蛋白水解的碎片， 被切的斷裂位點在氨基酸第68和第69位置間，

是一個精氨酸-絲氨酸序列， 被考慮是凝血酶活性的特定位點。 他們的發現與近期Streng等研究一致， 他們展現了初步證據， 隱含凝血酶是對cTnT降解的潛在物質之一。 Katrukha和合作者延伸了這些研究， 並提供了強烈的證據， 凝血酶可切斷cTnT， 產生觀察到的降解。

凝血酶不僅是一個蛋白水解的酶， 也會是cTnT降解的主要作俑者。 μ-鈣蛋白酶（calpain）和半胱天冬蛋白酶（caspase）， 在cTnT的降解中起著一個活躍的角色， 這是Di Lisa和其他展現的。 儘管μ-鈣蛋白酶和半胱天冬蛋白酶主要活躍在細胞內， 在體內生理的影響；凝血酶解調的降解看來是細胞外的， 大多在體外。 它會發生在在梗死位點， 但它也在血液收集管內的凝集中發生作用。

事實是， 多個酶共同消化cTnT，

可解釋該事實， Katrukha和合作者在凝血酶抑制劑下不能完全預防cTnT的降解。 他們的蛋白印跡分析也顯示了在患者血清中存在著較小分子量的cTnT碎片；但不清楚的是， 這些碎片是否來自被凝血酶切斷的多肽的進一步消化、或它們來自完整cTnT分子， 被其他非凝血酶的作用所致。 原先的研究和這些小碎片產生的機制， 不是近期文章的目標， 但是它很值得以後去研究。

cTnT的蛋白水解消化不是獨特的。 cTnI也是在體內和體外二者的蛋白水解降解的一個目標。 病原體的這樣識別和導致改變cTn氨基酸序列， 為實驗室學科提供了重要資訊。 檢測cTn濃度由免疫檢測實施， 依據被試劑抗體識別氨基酸短的序列， 所以被稱為決定簇。 改變或丟失決定簇可減少或防止抗體的附著， 導致假陰性實驗室結果。

儘管這是免疫檢測廠商的任務，去選擇抗體與某個決定簇反應，不受酶降解的影響，臨床醫生使用檢測結果，也必須懂得以往未被識別的決定簇的喪失有真正的可能性；明顯假陰性結果時必須以另一個診斷程式進行檢測。cTn大量的轉譯後消化也將使cTn檢測標準化和一致性複雜化，由於各種抗體將被不同影響，因降解和存在開裂的序列。cTn的酶降解研究，會證實對臨床實踐很有用，在廠商血液收集管內含有酶抑制劑，預防了體外對肌鈣蛋白的蛋白水解。

隨著近期引入質譜分析到臨床實驗室，你可假設，免疫檢測的干擾可以很快是過去的問題。但是，質譜分光分析也會要求用抗體進行免疫親和提取或免疫沉澱，cTn濃度檢測要求酶的消化，並由質譜分光對特定多肽序列的確認。丟失特徵的多肽序列可來自體內或體外的蛋白水解，會阻礙對cTn濃度檢測的準確度，即使是質譜分析。所以，cTn濃度的準確定量，要求理解和cTn分子的內部的和外部的心肌蛋白水解破碎。

本期臨床化學雜誌是一個提示，cTn檢測不是一個靜態的學科，cTn具有驚訝的特徵，即使在活躍的使用25年後，它們依然對臨床實驗室展現新挑戰。

導致假陰性實驗室結果。

儘管這是免疫檢測廠商的任務，去選擇抗體與某個決定簇反應，不受酶降解的影響，臨床醫生使用檢測結果，也必須懂得以往未被識別的決定簇的喪失有真正的可能性；明顯假陰性結果時必須以另一個診斷程式進行檢測。cTn大量的轉譯後消化也將使cTn檢測標準化和一致性複雜化，由於各種抗體將被不同影響，因降解和存在開裂的序列。cTn的酶降解研究，會證實對臨床實踐很有用，在廠商血液收集管內含有酶抑制劑，預防了體外對肌鈣蛋白的蛋白水解。

隨著近期引入質譜分析到臨床實驗室，你可假設，免疫檢測的干擾可以很快是過去的問題。但是，質譜分光分析也會要求用抗體進行免疫親和提取或免疫沉澱，cTn濃度檢測要求酶的消化，並由質譜分光對特定多肽序列的確認。丟失特徵的多肽序列可來自體內或體外的蛋白水解，會阻礙對cTn濃度檢測的準確度，即使是質譜分析。所以，cTn濃度的準確定量，要求理解和cTn分子的內部的和外部的心肌蛋白水解破碎。

本期臨床化學雜誌是一個提示，cTn檢測不是一個靜態的學科，cTn具有驚訝的特徵，即使在活躍的使用25年後，它們依然對臨床實驗室展現新挑戰。