鏡檢：先用小刀刮棄病甲表面疏鬆甲屑，再刮取甲屑於載坡片上，滴10%氫氧化鉀後加蓋玻片，在酒精燈上加熱以溶解角質。顯微鏡下可見孢子和菌絲。
培養：由於致病菌多樣，所用培養基應注意多樣化，應分別使用含和不含放線菌酮的沙堡弱培養基，以避免某此對放線菌酮敏感的菌被抑制而出現假陰性。若要分離馬拉色菌則要用含菜子油或橄欖油的培養基，35-37℃條件下培養。分離出不常見菌不能立即斷定為致病菌，但也不能輕易判斷為污染菌，應重複取材多次培養，才能確定其在致病中的地位。
組織病理學：是確定灰指甲診斷的另一種技術，儘量向近端多剪甲及甲下角化物，經脫鈣、軟化後切片，PAS或銀染色。可見甲組織中發現大量孢子和菌絲斷面，比培養發現真菌的陽性率高並有助於區別真菌是侵入甲還是僅僅定植在甲下脆屑。但因甲組織堅硬，處理操作過程較複雜，且有時在切片上難以確定是菌體或其他成分，需要一定經驗。
溶甲塗片：新近我們採用20%NaOH在56℃加熱30分鐘，將甲的角蛋白溶解，經離心、洗滌後取未被溶解的菌體成分塗片用Parker墨水染色，鏡下口請晰地見到菌絲或孢子，不僅可大大提高陽性率，而且能完整地觀察到菌體在甲內的形態特徵，發現了白念珠菌的頂端厚壁抱子、絲狀菌的關節孢子、麴菌的孢子頭、青黴菌的帚狀枝等結構，與純培養標本塗片所見一致，豐富了對灰指甲的認識。
電鏡觀察：包括掃描電鏡和透射電鏡，分別觀察表面和內部結構，主要用於研究。