Nature子刊：在標準即時PCR儀中超快地開展無校準測定

分子診斷在檢測遺傳疾病、監控抗癌療法療效和抵抗侵襲性細菌感染中發揮著越來越重要的作用。

隸屬於Scope Fluidics集團（Scope Fluidics group）的Curiosity Diagnostics公司（以下稱作CD公司）開發出一種新的DNA分析技術：協同PCR（synergistic PCR, sPCR）。這種方法將如今的兩種最為流行的遺傳密碼分析技術的優勢結合在一起，能夠在廣泛使用的儀器上執行。相關研究結果於2017年3月22日線上發表在Scientific Reports期刊上，論文標題為“Calibration-free assays on standard real-time PCR devices”。

波蘭科學院物理化學研究所（IPC-PAS）教授Piotr Garstecki（也在CD公司任職）說，“我們提出的這種DNA檢測技術是開發創新性的PCR|ONE分析儀期間想出的。

利用這種分析儀僅在7分鐘內就可完成對遺傳密碼的測試。它比常規測試方法所需的時間縮短了7倍多。”

用於DNA測定的樣品通常含有如此少的遺傳物質以至於利用常規的實驗室技術對它們進行分析是不可能的。在消除樣品中的雜質之後，第一步就是增加遺傳物質數量，經常增加高達10億倍。聚合酶鏈式反應（PCR）就是為完成此目標。

PCR擴增反應涉及對含有被擴增的遺傳物質和合適的試劑的溶液進行迴圈加熱和冷卻。

這些試劑包括一種催化DNA合成反應的聚合酶；合成DNA鏈所需的核苷酸；引物，即能夠結合到被擴增的遺傳密碼片段（如特定的基因）的起始處和結束處的短DNA片段。每個PCR迴圈分為加熱階段和冷卻階段。在加熱階段，在大約95℃的溫度下，DNA的氫鍵被破壞，因此DNA雙鏈分裂成兩個單鏈。在冷卻階段，在大約50℃的溫度下，溶液中的引物結合到這些DNA單鏈的對應位點上，此後，這種聚合酶合成出位於這些位點之間的互補鏈。在理想條件下，在每個迴圈結束時，雙鏈DNA片段的數量是每個迴圈開始時的2倍。

PCR被用來檢測遺傳物質的特定片段和估計遺傳物質的初始數量。定量測定通常是利用一種被稱作即時螢光PCR的模擬技術開展的。在對樣品進行擴增時，在隨後的擴增迴圈中，利用螢光染料檢測樣品中的DNA數量。

當螢光變化的強度超過一種設定的閾值時，遺傳物質的初始數量可基於迴圈數加以估計。這種模擬PCR技術是相對簡單的，但是由於PCR靈敏度，甚至顆粒雜質的存在，它需要仔細地和持續地校準。

另一種方法是數位PCR。樣品被等體積地分成幾萬或幾十萬份，有時甚至是幾百萬份。隨後，在每份樣品中，對遺傳物質進行擴增，而且如果設定的變化出現的話，那麼就測定它的數量。

在對樣品DNA進行分配期間，DNA分子僅適合進行一些分配，因此設定的變化不會都會出現。因此，樣品中的DNA初始數量能夠基於記錄的信號數量加以估計。數位技術的優勢在於沒有必要對數位PCR儀進行校準。然而，鑒於需要平行開展大量的反應，這種測試儀器是昂貴的，在實驗室中並不像模擬PCR儀那樣比較常見。

CD公司和IPC-PAS提出的sPCR技術將這種類比PCR和數位PCR方法最為重要的優勢結合在一起。為了獲得可靠的測量，對樣品僅稀釋十二份，或者最多幾十份。這種方法不需要校準。

在CD公司開發了這種sPCR方法的IPC-PAS博士生Pawel Debski說，“我們的技術的特徵是較少的稀釋份數，這具有十分重要的現實意義。”

由於少量的樣品稀釋份數，這種sPCR技術要比數位PCR更容易執行，而且略快一些。然而，相比於類比PCR技術，它需要更多的試劑。根據這些研究人員的說法，它將不會替換模擬PCR技術。不過，它可能是一種有價值的新技術，這是因為它不需校準，因而允許實驗室工作人員獨立地驗證模擬PCR測量的準確性。（www.bioeg.cn）

Garstecki強調道，“我們的DNA測試技術已被申請專利。不過，我們想要突出可自由地將它用於非商業目的。鑒於它利用常規的流行的基因測試儀器，所有你需要開始做的是獲得我們的文章。”

在標準的PCR儀中，樣品與附近的大塊交替加熱或冷卻材料之間相對較慢的熱量擴散被用來加熱和冷卻遺傳物質。在PCR|ONE儀器中，紅外線照射被用來快速地加熱樣品。擴散冷卻機制也被加以改進：用於這種目的的冷卻材料塊被常規的儀器中的更小，而且它被維持在一種恒定的嚴格受到控制的溫度下。由於技術改進和分析方法改進，這種PCR|ONE原型能夠在不到15分鐘內完成DNA分析，而且這種sPCR方法本身僅需7分鐘。首批PCR|ONE儀器最有可能將在兩到三年內上市。

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為了獲得可靠的測量，對樣品僅稀釋十二份，或者最多幾十份。這種方法不需要校準。

在CD公司開發了這種sPCR方法的IPC-PAS博士生Pawel Debski說，“我們的技術的特徵是較少的稀釋份數，這具有十分重要的現實意義。”

由於少量的樣品稀釋份數，這種sPCR技術要比數位PCR更容易執行，而且略快一些。然而，相比於類比PCR技術，它需要更多的試劑。根據這些研究人員的說法，它將不會替換模擬PCR技術。不過，它可能是一種有價值的新技術，這是因為它不需校準，因而允許實驗室工作人員獨立地驗證模擬PCR測量的準確性。（www.bioeg.cn）

Garstecki強調道，“我們的DNA測試技術已被申請專利。不過，我們想要突出可自由地將它用於非商業目的。鑒於它利用常規的流行的基因測試儀器，所有你需要開始做的是獲得我們的文章。”

在標準的PCR儀中，樣品與附近的大塊交替加熱或冷卻材料之間相對較慢的熱量擴散被用來加熱和冷卻遺傳物質。在PCR|ONE儀器中，紅外線照射被用來快速地加熱樣品。擴散冷卻機制也被加以改進：用於這種目的的冷卻材料塊被常規的儀器中的更小，而且它被維持在一種恒定的嚴格受到控制的溫度下。由於技術改進和分析方法改進，這種PCR|ONE原型能夠在不到15分鐘內完成DNA分析，而且這種sPCR方法本身僅需7分鐘。首批PCR|ONE儀器最有可能將在兩到三年內上市。

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