摘要不同殺青方式製備桑葉茶及其體外抗氧化作用研究摘要本實驗以桑葉為研究物件， 採用綠茶加工工藝製備桑茶， 特別考慮採用影響綠茶品質最重要的不同的殺青工藝並進行優化處理，
1．1桑葉概述桑是桑科( Moraceae) 桑屬多年生落葉小喬木植物，偶有灌木。桑原產於中國和朝鮮，全球約有16種，分佈于北溫帶、亞洲熱帶和非洲熱帶及美洲地區，我國約有11種，以江浙一帶為多�6�8 。中國是栽桑養蠶最早的國家。桑皮可作造紙原料，桑椹可供食用、釀酒，葉、果和根皮可入藥。葉為桑蠶飼料。桑葉不僅可用作家蠶的飼料，而且被作為一種發散風熱藥在我國醫藥中廣泛應用。中醫古籍強調“ 霜桑葉” 或“ 冬桑葉” 入藥。桑葉始載于《神農本草經》，歷代本草均有收載。桑葉苦、甘、寒，歸肺、肝經，具有疏散風熱、清肺潤燥、平肝明目、涼血止血之功效。現代藥理學研究顯示，桑葉具有降糖降脂、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，自二十世紀七十年代以來，人們對桑葉中的次生代謝產物進行了大量研究報導，從中提取分離並鑒定出多種化合物。
1．1．1桑葉的生物活性成分
1．1．1．1黃酮類化合物黃酮類物質是一種天然的強抗氧化劑，能夠清除人體中的多種自由基等，具有降血壓、抗衰老、防癌，抑制血清脂質增加和抑制動脈粥樣硬化形成的作用。桑葉中的黃酮類化合物占幹重的1％～3％，這些化合物主要包括芸香苷、槲皮素、異槲皮素、蘆丁、黃芪苷、異戊烯基黃烷等。日本學者Kayo掣51對桑葉的丁醇浸出物進行分離，得到9種化合物，尤其富含芸香苷，平均每1009幹品中，含芸香苷470～2670mg。
1．1．1．2多糖桑葉多糖具有顯著的降血糖作用，但關於其抗氧化方面的研究少有報導。研究表明，桑葉多糖在清除桑葉多糖可以顯著清除化學類比體系產生的OH· 自由基，是一種優良的OH· 清除劑，對DPPH· 也表現出一定的清除作用。此外，桑葉多糖能顯著降低H202誘導的小鼠肝臟MDA的形成和積累，並存在顯著的劑量效應。以上結果表明桑葉多糖具有良好的抗氧化作用。
1．1．1．3生物鹼1一去氧野尻黴素是一種呱啶生物鹼，簡稱為DNJ 。日本學者Asano掣61通過改變DNJ 的提取和純化工藝，從桑葉中分離出多種多羥基生物鹼，包括DNJ 、N一甲基一1一DNJ (NMe—DNJ )、2一氧一13, ．D半乳吡喃糖苷．1．DNJ 、1, 4．二去氧．1，4一亞胺基一D．阿拉伯糖醇、l ，4．二去氧．1，4．亞胺基一(2．氧．B．D一吡喃葡萄糖苷)一D一阿拉伯糖醇 兩南大學碩士學位論文等。DNJ 是一種天然糖的類似物，能夠抑制糖苷酶，能明顯抑制進食後血糖急劇上升現象。
1．1．1．4植物甾醇桑葉中植物甾醇含量比一般植物高3～4倍，由於植物甾醇同膽固醇在乳糜微粒的競爭，使得原本就溶解度不大的膽固醇成為不被吸收的狀態，從乳糜微粒中析出，而不能從腸道中進入血液，從而能有效的抑制腸道對膽固醇的吸收。植物固醇還可以促進膽固醇的排泄，Hayes等t71的研究提示，游離植物固醇能促進沙鼠內源性膽固醇的排泄。
1．1．1．51，一氨基丁酸桑葉中含有豐富的丫一氨基丁酸，丫一氨基丁酸由谷氨酸轉化而來，而桑葉中谷氨酸含量很高。GABA是中根神經系統的抑制性傳遞物質，是腦組織中最重要的神經遞質之一。其作用是降低神經元活性，防止神經細胞過熱( over fi ri ng) ，所以可從根本上鎮靜神經，起到抗焦慮的效果；同時，能提高葡萄糖磷酸酯酶活性，促進腦組織的新陳代謝和恢復腦細胞功能‘ 81。1．I．2桑葉保健功效Ⅲ51桑葉正是由於具有上述多種生物活性成分，因而有不少關於桑葉具有降血糖、抗應激、抗衰老、降血壓、增強肌體耐力，調節腎上腺素、降低膽固醇、抑制血栓生成，抑制腸內有害細菌繁殖，抗氧化、抗癌、抗過敏、防止動脈硬化、抗毛細管滲透、利尿、抑制對重金屬的吸收、抑菌、殺蟲、抗絲蟲病等多種功能，還具有治療禿頭症和減肥的藥用效力。最突出的功能是防止糖尿病，所以是一種價廉物美的新型功能性食品的基料。
1 . 2茶的加工概述
1．2．1茶的一般加工工藝我國是世界上茶類最豐富的國家，根據加工工藝方法和品質特徵可劃分為綠茶、黃茶、黑茶、白茶、烏龍茶和紅茶六大類。它們的品質風味各具一格，一方面是由於六大茶類對鮮葉原料的品種和嫩度要求不盡相同，更重要的是加工方法各異影響的品質特徵的實質主要是化學成分含量及組成的差異性。
1．2．1．1綠茶(green tea)工藝及品質形成[16-181綠茶是我國最主要的茶類，也是我國生產最多的茶類，約占總產量80％以上。中國所有產茶省( 區) 中，都有綠茶生產。由於我國的茶樹品種優良，自然條件 第1章文獻綜述適宜，加工工藝精良，從而形成了外形優美、高香、味道濃醇、湯色黃綠明亮、葉底嫩綠的綠茶風格。綠茶加工工藝如下：鮮葉_攤放一殺青一揉撚-÷ 分篩_÷ 烘二青。綠茶加工品質形成關鍵工序是殺青。殺青就是採用高溫鈍化鮮葉中生物酶的活性，儘量減少酚類物質的氧化和葉綠素的破壞，以形成綠茶傾聽綠葉的品質特點。但是因為殺青方式不同，如採用蒸汽殺青、鍋炒殺青、水潦殺青和微波殺青等不同方法，則可在很大程度上影響綠茶製品品質。
1．2．1．2紅茶(bl ack teal 工藝及品質形成吟211紅茶是占世界上茶葉消費量75％以上的茶類，也是我國生產的主要茶類之一，約占總產量的7％。消費紅茶的主要形式為紅碎茶。也有工夫紅茶。鮮葉_萎凋一揉切_解塊一發酵一烘乾_精製篩分_紅碎茶紅茶加工關鍵工藝是發酵，就是在前期萎凋使鮮葉失水，引起以大分子降解為主導的分解反應的基礎上，使鮮葉中的成分在酶的作用下發生氧化作用、酚類物質氧化、葉綠素降解，而形成紅茶特有的紅湯紅葉的品質特點。
1．2．1．3烏龍茶(ool ongtea)-l--黼質形成烏龍茶屬於半發酵茶，是我國特有的茶葉加工類型，約占總產量的11％。有福建閩南、閩北的鐵觀音和武夷岩茶等、廣東的鳳凰單叢和臺灣的烏龍茶等。每個不同的產地因為茶樹品種的差異以及加工工藝要點的把握而形成了不同產地烏龍茶特有的品質特點。烏龍茶一般加工工藝如下：鮮葉_萎凋_做青_殺青-÷ 揉撚一乾燥烏龍茶加工關鍵工藝處理是做青，即通過葉子放在太陽下萎凋，然後在竹篩中抖動，輕輕擦傷葉子邊緣，由於擦傷葉子中的茶多酚發生氧化反應，使得葉子邊緣轉變為微紅色，然後採用殺青工藝處理使這個輕微發酵立即停止，最終形成烏龍茶湯色為黃色或偏紅，具有花香或果香，外形綠葉紅鑲邊的品質特徵。
1．2．1．4其他茶類工藝及品質形成白茶是在茶葉新芽在張開以前就被採摘下來，先讓其水份自然蒸發，使葉片枯萎，然後乾燥，也稱為日曬茶，也是我國獨有的茶葉加工品類，因葉滿布白毫而得名，以鮮爽為上，香氣清新。主要加工工序為鮮葉～萎凋～乾燥。萎凋是白茶品質形成重要工序。黃茶是我國特有茶類，幹茶顯黃亮，茶湯呈嫩黃色，黃葉黃湯，香氣多板栗香。主要加工工序：鮮葉一殺青_悶黃一乾燥。因此黃茶主要加工工序為悶黃，通過悶黃將殺青葉趁熱堆積，使茶坯在濕熱條件下發生熱化學變化，最終使葉子全部均勻變黃為止。黑茶多為邊銷茶，湯色橙黃、香氣純J 下、滋味醇厚不澀，葉底黃褐均勻。加工工序：鮮葉一殺青一揉撚一÷ 渥堆．÷ 乾燥。渥堆是黑茶初制獨有的工序，也是黑茶色香味品質形成的關鍵工序。主要是在濕熱、微生物作用下多酚類物質自動氧化的結果。
1．2．2我國茶飲及加工技術的發展方向茶葉是我國重要的經濟作物，近年來，國際市場茶葉需求量不斷增大，這對我國茶葉在國外市場的開拓，提供了機遇。
1．2．2．1圍繞品質進行茶葉加工技術開發我國茶葉生產和加工存在的問題是，綠茶產品種類單一、加工較粗糙、色澤欠綠和煙焦味重等品質問題。為此，進行綠茶加工品質改進，加大新型綠茶加工技術的開發力度，是我國綠茶生產乃至我國整個茶產業發展的當務之急。近年來，有關加工工藝和設備的研究開發已取得相當進展。為了使綠茶產品色澤綠翠、保持良好香氣並消除煙焦味，將日本現行使用的蒸汽殺青和我國傳統使用的炒青乾燥工藝相結合，提出一種新型蒸炒型綠茶加工工藝技術‘ 2酣。有關茶葉設備生產企業，還開發出相應的蒸汽殺青設備，己在部分茶區開始應用，使加工的綠茶產品香氣滋味獲得較明顯改善，並且根除了傳統綠茶加工所易形成的煙焦味，只是要在蒸青後的脫水環節和產品綠翠保持技術上作進一步的改進和突破，很有可能形成一種新型綠茶產業化加工技術。
1．2．2t2名優茶將追求標準和規範化加工在一定時期內，名優茶仍將是我國茶產業的主導產品。名茶種類繁多，加工工藝和炒制手法各異，全國名茶種類達千種之多，但僅停留於手工藝品或樣品水準。同產品品質參差不齊，難以形成規模化加工和生產，嚴重制約著名優茶的市場和產業化優勢的形成。今後發展的趨勢是，茶區各地將應儘快按名茶加工工藝進行產品歸類，統一名茶產品的名稱和加工工藝技術，採用各種必要調控手段，減少名優茶的品類，避免同一類名茶名稱多樣，做到名茶生產一地一品 。分門別類制定各種名茶的產品加工標準，統一同一類名茶的加工工藝、品質和規格，減少名優茶的等級數目。從而增強名優茶的市場競爭力。
1．2．2．3茶葉產品將繼續向著多樣化、方便化的方向發展當今世界的茶葉生產和消費，正向著方便、多樣性、健康、經濟、品質、綜4 第1章文獻綜述合性的方向發展。茶葉作為一種廣受歡迎的天然飲料，隨著綜合利用的日益廣泛，茶葉在飲料、食品、醫藥等領域的應用研究正積極展開。同時，隨著人們生活水準的提高和飲茶習慣的改變，品質好、附加值高和應用高新技術開發生產的新型綠茶、即溶茶、袋泡茶、茶水飲料等產品，將成為茶葉消費新的增長點。例如以傳統茶葉作原料，經高科技提取、過濾、調配而形成的天然液體茶飲料，既具有茶葉的獨特風味，又可開蓋即飲，清潔衛生，適應當代人們生活節奏加快和現代化的潮流，近幾年發展速度很快。
1．2．2．4茶葉深加工產品的開發和生產力度將加大茶葉中含有數量眾多的有益於人體健康、可作為食品及醫藥添加的有效成分，並且大多可從較粗老的大宗茶原料中提取，產品附加值高，可使市場上因結構性原因而較滯銷的大宗茶原料獲得利用。目前我國的茶葉有效成分的製備，主要集中在茶多酚的提取和應用上【291，其次是咖啡因、茶多糖、茶色素，製備技術已經具備，但應用領域和技術尚待進一步開發：與此同時，我國已掌握單體兒茶素的製備技術，但工業化生產和應用技術還需深入研究和開發；茶氨酸的製備技術在研究中。
1．2．2．5新型茶飲的崛起隨著經濟的發展和人們生活水準的提高，人們對飲食與健康的要求也日益增高，除了對傳統茶飲的發展以外，人們也更加關注非茶類健康飲品的開發，如銀花茶、菊花茶、蕎麥茶、金蓮花茶、桂花茶、荷葉茶等等花草茶的開發及一些新資源花草茶的開發，茶已經變成這些健康飲品的代名詞。因此，新型茶飲的開發備受關注。
1．3生物活性物質體外抗氧化研究及抗氧化功能成分研究概述
1．3．1生物活性物質體外抗氧化評價方法概述氧化應激與許多病理學因素有關，如心血管病變、神經變性、癌症和衰老等。大量的臨床與流行病學研究顯示，消費富含生物活性物質的水果、蔬菜既可以有效降低癌症、心血管疾病和其他一些慢性疾病的發病率，又可以適度改善身體健康狀況。為此，天然產品的抗氧化能力成為了該領域的研究熱點，近年來建立了許多體外抗氧化能力的化學評價方法。抗氧化能力的的化學評價方法主要測定抗氧化劑針對某一種或某一類自由基的清除或抑制作用，作用機制主要有以下幾點：1) 抑制脂質過氧化；2) 清除自由基；3) 影響抗氧化酶的生物活性；4) 減少DNA的氧化損傷。 西南大學碩士學位論文
1 . 3．1．1．DPPH· 法DPPH法是Bl oi s於20世紀50年代提出的，最初用於發現食物中的供氫體，後來被廣泛用於定量評價生物製品、酚類和食品的抗氧化能力阻351。DPPH-法進行定量分析，測定簡便、快速，同時DPPH· 較長的半衰期使該方法保持了良好的重現性。DPPH-在有機溶劑中較為穩定，在波長517nm處有強吸收，當DPPH自由基清除劑存在時，DPPH· 的單電子與抗氧化劑中的H質子配對而被還原，溶液變淺，在517ri m處的吸光值降低，且這種顏色變淺的程度與配對電子數成化學劑量關係，即吸光值越低，樣品清除DPPH自由基能力越強，從而用於評價實驗樣品的抗氧化能力四。
1．3．1．2清除羥自由基(· OH)測定方法以清除羥自由基為基礎的化學評價方法較多，如亞硝基R鹽一C03+褪色法、水楊酸法、鄰二氮菲一Fe2+氧化法。基本原理都是通過氧化還原反應影響有色物質的含量變化，吸光值也會隨之發生改變，從而可判斷和評價供試樣品的抗氧化性能。趙豔紅等[341用鄰二氮菲．Fe2+氧化法、水楊酸比色法和亞硝基R鹽一C03+褪色法檢測茶多酚清除· OHfi 甚力，發現在實驗濃度範圍0～o．6mg／mL內均呈比較明顯的量效關係，進一一步的相關性分析表明，亞硝基R鹽．C03+褪色法的線性相關係數最接近1，可靠性最好。精密度和重現性分析中，亞硝基R鹽．C03+褪色法對茶多酚測量結果的RSD值明顯低於其他兩種方法，表明該方法的精密度和重現性都好。
1．3．1．3鐵離子還原能力( FRAP) 法鐵離子還原能力法由Benzi ei 建立，pH較低時，抗氧化功能物質能將三吡啶三嗪價三價鐵( TPTz．Fe3+) 的物質還原為藍色的三吡啶三嗪二價鐵( TPTZ—Fe2+) 。反應的結果常以Fe2+當量或標準物質的抗氧化能力表示。其優點是簡便、快捷、結果重複性較好。
1．3．1．4總氧自由基清除厶邕力(TOSC)法通過某種特定抗氧化成分或自由基代謝產物的變化研究生物抗氧化能力難以準確反映生物實際抗氧化應激的能力，因為單一成分的變化尚不能完全說明氧化損傷已經發生及其程度。Wi nston等建立的總氧自由基清除能力( TOSC) 法克服這種局限性，以氣相色譜或液相色譜為檢測手段檢測機體的總氧自由基清除能力，其優勢是能較全而地反映機體的抗活性氧毒性能力的實際水準，是目前測定總氧自由基的常用方法[37-391。
1．3．1．5氧自由基吸收能( ORAC) 法6 第1章文獻綜述oRAc法是建立在Gl azer實驗基礎上的一種檢測抗氧化能力的方法。p一藻紅蛋白( 13-phycoerythri n，p．PE) 為螢光指示蛋白，在AAPH· 、Cu2+．H202體系產生的自由基攻擊下在565nm波長下的螢光度會減弱或消失，通過與VE類似物Trol ox的抗氧化能力進行直接比較而得到抗氧化能力的當量值，根據其螢光強度衰減曲線變化計算出樣品的自由基清除能力‘ 40‘ 411。Laura Bravo[ 421在ORAC的基礎上，對Il exparaguari ensi s的抗氧化機制做了深入的研究，結果表明多酚類物質含量與抗氧化能力呈正相關，主要功能成分包括兒茶素、黃酮類、花色素和酚酸，其中兒茶素最為重要，約占多酚類總量的60％～80％。
1．3．2抗氧化功能成分研究概述植物浸出物的抗氧化活性成分主要有黃酮類化合物、多酚類化合物、維生素等類型。
1．3．2．1黃酮類化合物黃酮類化合物是大都具有顯著的抗氧化功能，槲皮素、葛根素、金絲桃苷、桑色素、山奈酚等。從金蓮花、竹葉、黃芪、葛根和沙棘等醇提物分離的黃酮類物質均具表現出較強的自由基清除能力。唐津忠等【471研究了金蓮花中黃酮類化合物的提取及其對豬油的抗氧化作用，結果表明，黃酮類化合物對豬油有明顯的抗氧化作用，黃酮類化合物的添加量在試驗劑量範圍內與其抗氧化性呈正相關；金蓮花中黃酮類化合物與Vc有較好的增效協同效應。陸柏益[ 48] 研究了竹葉黃酮的體內外抗氧化活性，實驗表明，竹葉黃酮具有清除自由基、抗脂質過氧化、提升體內抗氧化水準的作用。
1．3．2 12多酚類化合物植物多酚又稱植物單寧，是植物體內的複雜酚類次生代謝產物植物多酚由於其所具有的獨特功能活性，已成為當今研究開發的熱點，並在現實生產中得到廣泛應用。宋薇薇等‘ 521研究了石榴皮提取物對羥自由清除作用和小鼠肝勻漿脂質過氧化的抑制作用，結果表明，石榴皮中的多酚物質能抗氧化作用明顯，其半抑制濃度IC50，EC50分別0．288mg／mL、O．0079mg／mL。茶多酚能有效滅活體內的自由基，對自由基引起的氧化損傷有很好的防護作用。研究表明，茶多酚能對紫外線引起的人紅細胞溶血及維生素C／Fe2+激發的肝勻漿谷胱甘肽耗竭均有顯著的抑制作用。能保護體外紅細胞、組織谷胱甘肽及DNA免受氧自由基損傷。
1．3．2．3維生素類【54刪】維生素E、維生素c及其衍生物，既是食品營養素，又可作為抗氧化劑。許多 西南大學碩士學位論文水果和蔬菜中富維生素E、維生素C等物質。水溶性維生素C可以協同維生素E抵抗氧自由基，其機理為維生素C消除環境中的氧自由基而保護維生素E，節省維生素E的使用。維生素E是脂溶性小分子抗氧化劑代表性物頃．可以防止細胞膜上的脂質被氧化，否則因其氧化產生的脂褐素會促使細胞衰老，從而影響組織器官的生理功能。蔬菜中的p一胡蘿蔔素或番茄紅素可與過氧化氫自由基反應生成碳自由基而穩定下來。水溶性維生素B族是若干抗氧化酶的輔酶，使抗氧化酶起到清除自由基等抗氧化的作用。
1．3．2．4皂苷類近年來的研究表明，皂苷大多具有明顯的抗氧化作用，皂苷類的抗氧化作用則可能是其延緩衰老、抗動脈粥樣硬化、抗缺血再灌注損傷等藥理作用的共同作用機制。根據苷元的化學結構分為甾體皂苷和三萜皂苷兩類。人參、刺五加、升麻、黃芪中含有萜類皂苷，麥冬、洋地黃、黨參中含有甾類皂苷，這些皂甙均可抑制自由基的形成[ 601。其他具抗氧化活性的皂苷還有三七總皂苷、西洋參皂苷、絞股藍皂苷。柴胡根含皂苷約2％，主要皂苷為柴胡皂苷a、c年l J d，果實亦含多種皂苷。黨參根含三萜類化合物、皂苷、多種甾醇和甾苷等。人參皂苷Rb 1和人參皂苷R93的混合物能阻止神經元產生過量硝酸，延緩衰老。
1．3．2．5其他類現代研究發現，多糖可通過直接清除ROS、絡合產生ROS所必需的金屬離子等途徑實現抗氧化作用。香菇、靈芝、豬苓和木耳等真菌子實體提取的多糖也具有防治癌症的作用，特別是硫酸多糖具有多種生理活性‘。氨基酸和蛋白質在植物體內可以以游離形式存在，更多的是以與多糖、酚類化合物等結合的形式存在，均具有抗氧化活性，單寧．蛋白質複合物也可清除自由基。不飽和脂肪酸、維生素、礦物質等也均為有效的抗氧化成分。
1．4天然抗氧化劑的細胞抗氧化作用的研究進展。
1．4．1細胞抗氧化原理利用螢光探針DCFH—DA檢測細胞內活性氧的變化。用抗氧化劑混合物以及無螢光的DCFH．DA處理肝癌細胞，二者進入細胞後，在細胞酯酶的作用下，DCFH—DA被分解成還原型二氯螢光素( DCFH) 。DCFH不能透過細胞膜到達細胞外。ABAP處理細胞，ABAP進入細胞後自發降解為過氧化自由基形成過氧化自由基，從而誘發細胞產生活性氧。細胞內的DCFH極易被活性氧氧化成螢光物氧化型二氯螢光素( DCH) ，螢光物DCH可通過分光光度法測定。抗氧化劑能夠結 第1章文獻綜述合細胞中的活性氧，從而阻斷有綠色螢光的DCF的生成。細胞螢光物質的減少量就能反映該化合物的抗氧化能力。螢光值越小，抗氧化劑的抗氧化能力越高。
1．4．2天然抗氧化劑的細胞抗氧化能力研究細胞抗氧化測定方法往往通過抗細胞增殖能力來反映其體內抗氧化效果，主要用於食物如果蔬、穀物、豆類和純植物化學物質等的抗氧化活性的評價。果蔬組織內的抗氧化活性成分是當前科學研究的熱點，國外研究者相繼從多種果蔬中提取並鑒定出抗氧化成分，並測定其抗氧化能力。Eberhardt等[ 68-69] 對蘋果抑制Caco一2和HepG一2細胞增殖的能力進行了研究，結果表明，帶皮和去皮的蘋果沸水浸出物質量濃度各為50mg／mL時，對Caco一2的抑制率分別為( 43士1y％和(29士4．1)％，對HepG．2的抑制率分別為(57士0．21)％和(40士0．64)％，說明帶皮蘋果的提取物較去皮蘋果的提取物抑制癌細胞增殖的能力強。常見水果中，蔓越橘、檸檬、蘋果、草莓、葡萄、香蕉、桃子對HepG．2細胞增殖抑制的EC50值依次增加，即抑制細胞增殖的能力依次減弱；常見蔬菜中，菠菜、大白菜、紅辣椒、洋蔥、花椰菜、土豆和甜菜的EC50值依次增加，即抑制HepG一2細胞增殖的能力依次減弱。大量實驗證實，被測物的提取濃度與抑制細胞增殖的能力是存在劑量一效應關係的，提取物濃度越大，抗增殖能力越強。Wol fe等測定了幾十種常見水果蔬菜提取物的抗氧化活性，發現兩種不同處理方法( 不用PBS和用PBS) 鋇4得蘋果的CAA值分別為( 21．9士4．0) “ molQE／1009和(17．2士2．0)p．mol QE／1009，野生藍莓的CAA值分別為( 292士11) I．tmol QE／1009和(74．1士12．5)umol QE／1009。漿果類一般具有較高的CAA值，如野生藍莓、草莓、黑莓、樹莓等，而瓜果類的CAA值較低，如哈密瓜等。蔬菜中則是甜菜、花椰菜和紅辣椒的CAA值較高。CAA值高低與總酚含量是密切相關的。穀物中也含有酚酸類、黃酮類、單寧等酚類化合物，含量和種類與果蔬中的相當，與果蔬不同的是穀物中的酚大多是結合酚，很多實驗都證明穀物如有色稻米等具有抗氧化活性。研究發現，米糠提取物對細胞HL一60和MOL．4的IC50值分別為2．3mg／kg和2．8mg／kg。Hu Chun等【73J 用RAW264．7細胞系證明了深藍色粒小麥的麥麩能使H：02自由基氧化產生的螢光迅速減少，且存在劑量．效應關係。採用CAA方法用於評價純植物化學物質的抗氧化活性時發現：具有3’ ，4’ 一O一二羥基、2，3雙鍵結合。酮基、3．羥基結構的類黃酮具有較高的CAA值；不同純植物化學物質中，槲皮素的CAA值最高，山奈酚、表沒食子兒茶素沒食予酸酯(EGCG)、楊梅酮、木犀草素次之。以wbl fe等的CAA方法以及Honzel 掣7的基於人體血紅細胞的CAP—e方法( cel l ．based anti ．oxi dantprotecti on as—say uti l i si ngerythrocytes) 為基礎，Bl asa等，建立了CAA—RBC方法( cel l ul aranti oxi dantacti vi ty9 西南大學碩士學位論文uti l i si ngredbl oodcel l s) ，用該方法對各種提純的黃酮類物質進行分析，發現異鼠李素、楊梅酮、山奈酚表現出較高細胞抗氧化活性，而木犀草素、EGCG、白藜蘆醇、芹菜素和兒茶素表現出較低活性，與上述CAA方法分析得到的結果有一定差異。此外，CAA方法在豆類、咖啡、茶葉( 茶多酚) 等提取物的細胞抗氧化活性研究中也有應用。
2．1研究目的與意義桑葉是一種藥食兩用的天然植物資源，近年來，桑葉中的營養及功能成分成為國內外研究的熱點，大量研究表明，桑葉中的生物活性物質如多酚類物質、黃酮甙，桑多糖、生物鹼等，在降血糖、降血壓、抗衰老、抗氧化，調節。腎上腺素、降低膽固醇、預防血栓，改善腸道健康，抗癌、抗過敏、防止動脈硬化、利尿等方面具有顯著的功效。我國桑樹資源豐富，而傳統的栽桑養蠶模式單一，桑葉消耗量少，每年有大量的桑葉得不到有效的利用，考慮桑葉具有的功能成分特點，以及我國傳統醫學對桑葉的利用，以及茶飲在我國民間的普及，探索開發桑葉的新用途，將桑葉按照茶葉加工工藝製備加工桑茶，對桑葉利用具有十分重要的意義。中國是人類種茶、制茶、飲茶的發源地，茶文化源遠流長。茶葉作為世界三大飲料之一，廣受全球消費者歡迎，市場對其數量、品質的需求正在逐漸增加與提高，經濟價值巨大。以桑作茶在我國已有一千多年歷史，但我國直到1992年才開始發展桑葉茶，目前國內尚處於技術研究市場開發啟動階段，沒有批量商品上市。隨著人們消費觀念和健康理念的轉變，桑葉茶作為藥食兩用的健康食品，必將越來越被人們所青睞，具有廣闊的市場前景。本研究擬採用藥食兩用資源桑鮮葉為原料，採用茶葉中綠茶加工工藝製備桑茶，特別考慮採用影響綠茶品質的關鍵工藝——殺青，並進行優化處理，來製備目標功能成分含量高及滋味品質好的桑茶，同時針對桑葉富含抗氧化的酚類物質等特點，對製備桑茶抗氧化功能作用進行深入研究，包括體外抗氧化活性和細胞內抗氧化活性，可為研究桑葉茶工藝特點、生物活性成分與其抗氧化活性之問的相關性提供了實驗依據，為桑鮮葉資源的開發利用提供新的思路。考慮桑茶含有的抗氧化成分差異，為此，本實驗在抗氧化活性研究中，考慮了不同溶劑提取對桑葉茶的抗氧化活性的影響，並分別採用了體外抗氧化方法和細胞內抗氧化方法對桑葉茶不同溶劑浸出物的抗氧化能力進行了研究，並對兩種方法的測定結果做了相關性分析，為桑葉茶功能化開發和應用提供有關抗氧化方面的基礎研究資料，有一定的意義。
2．2主要研究內容
不同殺青工藝處理對桑葉茶主要生物活性成分及品質的影響研究殺青是綠茶製備最重要的工序。本部分擬採用綠茶加工工藝中不同殺青工藝 兩南大學碩士學位論文對桑鮮葉進行處理，研究殺青工藝對桑葉茶品質的影響。
這與體外抗氧化方法得到的結果相似。桑葉茶不同提取物的細胞抗氧化能力與化學抗氧化能力沒有直接相關性，有些化學抗氧化能力很強的成分其細胞抗Il 摘要氧化能力都非常小，無法計算EC50。所以化學抗氧化能力很強的物質不一定就能夠進入體內清除自由基，也就是說單獨用化學抗氧化方法評價某物質的抗氧化能力並不科學，建議通過建立細胞模型測綜合評價抗氧化性。關鍵字：桑葉茶；殺青工藝；多酚類；黃酮類；體外抗氧化；細胞內抗氧化 ；1．1桑葉概述桑是桑科( Moraceae) 桑屬多年生落葉小喬木植物，偶有灌木。桑原產於中國和朝鮮，全球約有16種，分佈于北溫帶、亞洲熱帶和非洲熱帶及美洲地區，我國約有11種，以江浙一帶為多�6�8 。中國是栽桑養蠶最早的國家。桑皮可作造紙原料，桑椹可供食用、釀酒，葉、果和根皮可入藥。葉為桑蠶飼料。桑葉不僅可用作家蠶的飼料，而且被作為一種發散風熱藥在我國醫藥中廣泛應用。中醫古籍強調“ 霜桑葉” 或“ 冬桑葉” 入藥。桑葉始載于《神農本草經》，歷代本草均有收載。桑葉苦、甘、寒，歸肺、肝經，具有疏散風熱、清肺潤燥、平肝明目、涼血止血之功效。現代藥理學研究顯示，桑葉具有降糖降脂、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，自二十世紀七十年代以來，人們對桑葉中的次生代謝產物進行了大量研究報導，從中提取分離並鑒定出多種化合物。
1．1．1桑葉的生物活性成分
1．1．1．1黃酮類化合物黃酮類物質是一種天然的強抗氧化劑，能夠清除人體中的多種自由基等，具有降血壓、抗衰老、防癌，抑制血清脂質增加和抑制動脈粥樣硬化形成的作用。桑葉中的黃酮類化合物占幹重的1％～3％，這些化合物主要包括芸香苷、槲皮素、異槲皮素、蘆丁、黃芪苷、異戊烯基黃烷等。日本學者Kayo掣51對桑葉的丁醇浸出物進行分離，得到9種化合物，尤其富含芸香苷，平均每1009幹品中，含芸香苷470～2670mg。
1．1．1．2多糖桑葉多糖具有顯著的降血糖作用，但關於其抗氧化方面的研究少有報導。研究表明，桑葉多糖在清除桑葉多糖可以顯著清除化學類比體系產生的OH· 自由基，是一種優良的OH· 清除劑，對DPPH· 也表現出一定的清除作用。此外，桑葉多糖能顯著降低H202誘導的小鼠肝臟MDA的形成和積累，並存在顯著的劑量效應。以上結果表明桑葉多糖具有良好的抗氧化作用。
1．1．1．3生物鹼1一去氧野尻黴素是一種呱啶生物鹼，簡稱為DNJ 。日本學者Asano掣61通過改變DNJ 的提取和純化工藝，從桑葉中分離出多種多羥基生物鹼，包括DNJ 、N一甲基一1一DNJ (NMe—DNJ )、2一氧一13, ．D半乳吡喃糖苷．1．DNJ 、1, 4．二去氧．1，4一亞胺基一D．阿拉伯糖醇、l ，4．二去氧．1，4．亞胺基一(2．氧．B．D一吡喃葡萄糖苷)一D一阿拉伯糖醇 兩南大學碩士學位論文等。DNJ 是一種天然糖的類似物，能夠抑制糖苷酶，能明顯抑制進食後血糖急劇上升現象。
1．1．1．4植物甾醇桑葉中植物甾醇含量比一般植物高3～4倍，由於植物甾醇同膽固醇在乳糜微粒的競爭，使得原本就溶解度不大的膽固醇成為不被吸收的狀態，從乳糜微粒中析出，而不能從腸道中進入血液，從而能有效的抑制腸道對膽固醇的吸收。植物固醇還可以促進膽固醇的排泄，Hayes等t71的研究提示，游離植物固醇能促進沙鼠內源性膽固醇的排泄。
1．1．1．51，一氨基丁酸桑葉中含有豐富的丫一氨基丁酸，丫一氨基丁酸由谷氨酸轉化而來，而桑葉中谷氨酸含量很高。GABA是中根神經系統的抑制性傳遞物質，是腦組織中最重要的神經遞質之一。其作用是降低神經元活性，防止神經細胞過熱( over fi ri ng) ，所以可從根本上鎮靜神經，起到抗焦慮的效果；同時，能提高葡萄糖磷酸酯酶活性，促進腦組織的新陳代謝和恢復腦細胞功能‘ 81。1．I．2桑葉保健功效Ⅲ51桑葉正是由於具有上述多種生物活性成分，因而有不少關於桑葉具有降血糖、抗應激、抗衰老、降血壓、增強肌體耐力，調節腎上腺素、降低膽固醇、抑制血栓生成，抑制腸內有害細菌繁殖，抗氧化、抗癌、抗過敏、防止動脈硬化、抗毛細管滲透、利尿、抑制對重金屬的吸收、抑菌、殺蟲、抗絲蟲病等多種功能，還具有治療禿頭症和減肥的藥用效力。最突出的功能是防止糖尿病，所以是一種價廉物美的新型功能性食品的基料。
1 . 2茶的加工概述
1．2．1茶的一般加工工藝我國是世界上茶類最豐富的國家，根據加工工藝方法和品質特徵可劃分為綠茶、黃茶、黑茶、白茶、烏龍茶和紅茶六大類。它們的品質風味各具一格，一方面是由於六大茶類對鮮葉原料的品種和嫩度要求不盡相同，更重要的是加工方法各異影響的品質特徵的實質主要是化學成分含量及組成的差異性。
1．2．1．1綠茶(green tea)工藝及品質形成[16-181綠茶是我國最主要的茶類，也是我國生產最多的茶類，約占總產量80％以上。中國所有產茶省( 區) 中，都有綠茶生產。由於我國的茶樹品種優良，自然條件 第1章文獻綜述適宜，加工工藝精良，從而形成了外形優美、高香、味道濃醇、湯色黃綠明亮、葉底嫩綠的綠茶風格。綠茶加工工藝如下：鮮葉_攤放一殺青一揉撚-÷ 分篩_÷ 烘二青。綠茶加工品質形成關鍵工序是殺青。殺青就是採用高溫鈍化鮮葉中生物酶的活性，儘量減少酚類物質的氧化和葉綠素的破壞，以形成綠茶傾聽綠葉的品質特點。但是因為殺青方式不同，如採用蒸汽殺青、鍋炒殺青、水潦殺青和微波殺青等不同方法，則可在很大程度上影響綠茶製品品質。
1．2．1．2紅茶(bl ack teal 工藝及品質形成吟211紅茶是占世界上茶葉消費量75％以上的茶類，也是我國生產的主要茶類之一，約占總產量的7％。消費紅茶的主要形式為紅碎茶。也有工夫紅茶。鮮葉_萎凋一揉切_解塊一發酵一烘乾_精製篩分_紅碎茶紅茶加工關鍵工藝是發酵，就是在前期萎凋使鮮葉失水，引起以大分子降解為主導的分解反應的基礎上，使鮮葉中的成分在酶的作用下發生氧化作用、酚類物質氧化、葉綠素降解，而形成紅茶特有的紅湯紅葉的品質特點。
1．2．1．3烏龍茶(ool ongtea)-l--黼質形成烏龍茶屬於半發酵茶，是我國特有的茶葉加工類型，約占總產量的11％。有福建閩南、閩北的鐵觀音和武夷岩茶等、廣東的鳳凰單叢和臺灣的烏龍茶等。每個不同的產地因為茶樹品種的差異以及加工工藝要點的把握而形成了不同產地烏龍茶特有的品質特點。烏龍茶一般加工工藝如下：鮮葉_萎凋_做青_殺青-÷ 揉撚一乾燥烏龍茶加工關鍵工藝處理是做青，即通過葉子放在太陽下萎凋，然後在竹篩中抖動，輕輕擦傷葉子邊緣，由於擦傷葉子中的茶多酚發生氧化反應，使得葉子邊緣轉變為微紅色，然後採用殺青工藝處理使這個輕微發酵立即停止，最終形成烏龍茶湯色為黃色或偏紅，具有花香或果香，外形綠葉紅鑲邊的品質特徵。
1．2．1．4其他茶類工藝及品質形成白茶是在茶葉新芽在張開以前就被採摘下來，先讓其水份自然蒸發，使葉片枯萎，然後乾燥，也稱為日曬茶，也是我國獨有的茶葉加工品類，因葉滿布白毫而得名，以鮮爽為上，香氣清新。主要加工工序為鮮葉～萎凋～乾燥。萎凋是白茶品質形成重要工序。黃茶是我國特有茶類，幹茶顯黃亮，茶湯呈嫩黃色，黃葉黃湯，香氣多板栗香。主要加工工序：鮮葉一殺青_悶黃一乾燥。因此黃茶主要加工工序為悶黃，通過悶黃將殺青葉趁熱堆積，使茶坯在濕熱條件下發生熱化學變化，最終使葉子全部均勻變黃為止。黑茶多為邊銷茶，湯色橙黃、香氣純J 下、滋味醇厚不澀，葉底黃褐均勻。加工工序：鮮葉一殺青一揉撚一÷ 渥堆．÷ 乾燥。渥堆是黑茶初制獨有的工序，也是黑茶色香味品質形成的關鍵工序。主要是在濕熱、微生物作用下多酚類物質自動氧化的結果。
1．2．2我國茶飲及加工技術的發展方向茶葉是我國重要的經濟作物，近年來，國際市場茶葉需求量不斷增大，這對我國茶葉在國外市場的開拓，提供了機遇。
1．2．2．1圍繞品質進行茶葉加工技術開發我國茶葉生產和加工存在的問題是，綠茶產品種類單一、加工較粗糙、色澤欠綠和煙焦味重等品質問題。為此，進行綠茶加工品質改進，加大新型綠茶加工技術的開發力度，是我國綠茶生產乃至我國整個茶產業發展的當務之急。近年來，有關加工工藝和設備的研究開發已取得相當進展。為了使綠茶產品色澤綠翠、保持良好香氣並消除煙焦味，將日本現行使用的蒸汽殺青和我國傳統使用的炒青乾燥工藝相結合，提出一種新型蒸炒型綠茶加工工藝技術‘ 2酣。有關茶葉設備生產企業，還開發出相應的蒸汽殺青設備，己在部分茶區開始應用，使加工的綠茶產品香氣滋味獲得較明顯改善，並且根除了傳統綠茶加工所易形成的煙焦味，只是要在蒸青後的脫水環節和產品綠翠保持技術上作進一步的改進和突破，很有可能形成一種新型綠茶產業化加工技術。
1．2．2t2名優茶將追求標準和規範化加工在一定時期內，名優茶仍將是我國茶產業的主導產品。名茶種類繁多，加工工藝和炒制手法各異，全國名茶種類達千種之多，但僅停留於手工藝品或樣品水準。同產品品質參差不齊，難以形成規模化加工和生產，嚴重制約著名優茶的市場和產業化優勢的形成。今後發展的趨勢是，茶區各地將應儘快按名茶加工工藝進行產品歸類，統一名茶產品的名稱和加工工藝技術，採用各種必要調控手段，減少名優茶的品類，避免同一類名茶名稱多樣，做到名茶生產一地一品 。分門別類制定各種名茶的產品加工標準，統一同一類名茶的加工工藝、品質和規格，減少名優茶的等級數目。從而增強名優茶的市場競爭力。
1．2．2．3茶葉產品將繼續向著多樣化、方便化的方向發展當今世界的茶葉生產和消費，正向著方便、多樣性、健康、經濟、品質、綜4 第1章文獻綜述合性的方向發展。茶葉作為一種廣受歡迎的天然飲料，隨著綜合利用的日益廣泛，茶葉在飲料、食品、醫藥等領域的應用研究正積極展開。同時，隨著人們生活水準的提高和飲茶習慣的改變，品質好、附加值高和應用高新技術開發生產的新型綠茶、即溶茶、袋泡茶、茶水飲料等產品，將成為茶葉消費新的增長點。例如以傳統茶葉作原料，經高科技提取、過濾、調配而形成的天然液體茶飲料，既具有茶葉的獨特風味，又可開蓋即飲，清潔衛生，適應當代人們生活節奏加快和現代化的潮流，近幾年發展速度很快。
1．2．2．4茶葉深加工產品的開發和生產力度將加大茶葉中含有數量眾多的有益於人體健康、可作為食品及醫藥添加的有效成分，並且大多可從較粗老的大宗茶原料中提取，產品附加值高，可使市場上因結構性原因而較滯銷的大宗茶原料獲得利用。目前我國的茶葉有效成分的製備，主要集中在茶多酚的提取和應用上【291，其次是咖啡因、茶多糖、茶色素，製備技術已經具備，但應用領域和技術尚待進一步開發：與此同時，我國已掌握單體兒茶素的製備技術，但工業化生產和應用技術還需深入研究和開發；茶氨酸的製備技術在研究中。
1．2．2．5新型茶飲的崛起隨著經濟的發展和人們生活水準的提高，人們對飲食與健康的要求也日益增高，除了對傳統茶飲的發展以外，人們也更加關注非茶類健康飲品的開發，如銀花茶、菊花茶、蕎麥茶、金蓮花茶、桂花茶、荷葉茶等等花草茶的開發及一些新資源花草茶的開發，茶已經變成這些健康飲品的代名詞。因此，新型茶飲的開發備受關注。
1．3生物活性物質體外抗氧化研究及抗氧化功能成分研究概述
1．3．1生物活性物質體外抗氧化評價方法概述氧化應激與許多病理學因素有關，如心血管病變、神經變性、癌症和衰老等。大量的臨床與流行病學研究顯示，消費富含生物活性物質的水果、蔬菜既可以有效降低癌症、心血管疾病和其他一些慢性疾病的發病率，又可以適度改善身體健康狀況。為此，天然產品的抗氧化能力成為了該領域的研究熱點，近年來建立了許多體外抗氧化能力的化學評價方法。抗氧化能力的的化學評價方法主要測定抗氧化劑針對某一種或某一類自由基的清除或抑制作用，作用機制主要有以下幾點：1) 抑制脂質過氧化；2) 清除自由基；3) 影響抗氧化酶的生物活性；4) 減少DNA的氧化損傷。 西南大學碩士學位論文
1 . 3．1．1．DPPH· 法DPPH法是Bl oi s於20世紀50年代提出的，最初用於發現食物中的供氫體，後來被廣泛用於定量評價生物製品、酚類和食品的抗氧化能力阻351。DPPH-法進行定量分析，測定簡便、快速，同時DPPH· 較長的半衰期使該方法保持了良好的重現性。DPPH-在有機溶劑中較為穩定，在波長517nm處有強吸收，當DPPH自由基清除劑存在時，DPPH· 的單電子與抗氧化劑中的H質子配對而被還原，溶液變淺，在517ri m處的吸光值降低，且這種顏色變淺的程度與配對電子數成化學劑量關係，即吸光值越低，樣品清除DPPH自由基能力越強，從而用於評價實驗樣品的抗氧化能力四。
1．3．1．2清除羥自由基(· OH)測定方法以清除羥自由基為基礎的化學評價方法較多，如亞硝基R鹽一C03+褪色法、水楊酸法、鄰二氮菲一Fe2+氧化法。基本原理都是通過氧化還原反應影響有色物質的含量變化，吸光值也會隨之發生改變，從而可判斷和評價供試樣品的抗氧化性能。趙豔紅等[341用鄰二氮菲．Fe2+氧化法、水楊酸比色法和亞硝基R鹽一C03+褪色法檢測茶多酚清除· OHfi 甚力，發現在實驗濃度範圍0～o．6mg／mL內均呈比較明顯的量效關係，進一一步的相關性分析表明，亞硝基R鹽．C03+褪色法的線性相關係數最接近1，可靠性最好。精密度和重現性分析中，亞硝基R鹽．C03+褪色法對茶多酚測量結果的RSD值明顯低於其他兩種方法，表明該方法的精密度和重現性都好。
1．3．1．3鐵離子還原能力( FRAP) 法鐵離子還原能力法由Benzi ei 建立，pH較低時，抗氧化功能物質能將三吡啶三嗪價三價鐵( TPTz．Fe3+) 的物質還原為藍色的三吡啶三嗪二價鐵( TPTZ—Fe2+) 。反應的結果常以Fe2+當量或標準物質的抗氧化能力表示。其優點是簡便、快捷、結果重複性較好。
1．3．1．4總氧自由基清除厶邕力(TOSC)法通過某種特定抗氧化成分或自由基代謝產物的變化研究生物抗氧化能力難以準確反映生物實際抗氧化應激的能力，因為單一成分的變化尚不能完全說明氧化損傷已經發生及其程度。Wi nston等建立的總氧自由基清除能力( TOSC) 法克服這種局限性，以氣相色譜或液相色譜為檢測手段檢測機體的總氧自由基清除能力，其優勢是能較全而地反映機體的抗活性氧毒性能力的實際水準，是目前測定總氧自由基的常用方法[37-391。
1．3．1．5氧自由基吸收能( ORAC) 法6 第1章文獻綜述oRAc法是建立在Gl azer實驗基礎上的一種檢測抗氧化能力的方法。p一藻紅蛋白( 13-phycoerythri n，p．PE) 為螢光指示蛋白，在AAPH· 、Cu2+．H202體系產生的自由基攻擊下在565nm波長下的螢光度會減弱或消失，通過與VE類似物Trol ox的抗氧化能力進行直接比較而得到抗氧化能力的當量值，根據其螢光強度衰減曲線變化計算出樣品的自由基清除能力‘ 40‘ 411。Laura Bravo[ 421在ORAC的基礎上，對Il exparaguari ensi s的抗氧化機制做了深入的研究，結果表明多酚類物質含量與抗氧化能力呈正相關，主要功能成分包括兒茶素、黃酮類、花色素和酚酸，其中兒茶素最為重要，約占多酚類總量的60％～80％。
1．3．2抗氧化功能成分研究概述植物浸出物的抗氧化活性成分主要有黃酮類化合物、多酚類化合物、維生素等類型。
1．3．2．1黃酮類化合物黃酮類化合物是大都具有顯著的抗氧化功能，槲皮素、葛根素、金絲桃苷、桑色素、山奈酚等。從金蓮花、竹葉、黃芪、葛根和沙棘等醇提物分離的黃酮類物質均具表現出較強的自由基清除能力。唐津忠等【471研究了金蓮花中黃酮類化合物的提取及其對豬油的抗氧化作用，結果表明，黃酮類化合物對豬油有明顯的抗氧化作用，黃酮類化合物的添加量在試驗劑量範圍內與其抗氧化性呈正相關；金蓮花中黃酮類化合物與Vc有較好的增效協同效應。陸柏益[ 48] 研究了竹葉黃酮的體內外抗氧化活性，實驗表明，竹葉黃酮具有清除自由基、抗脂質過氧化、提升體內抗氧化水準的作用。
1．3．2 12多酚類化合物植物多酚又稱植物單寧，是植物體內的複雜酚類次生代謝產物植物多酚由於其所具有的獨特功能活性，已成為當今研究開發的熱點，並在現實生產中得到廣泛應用。宋薇薇等‘ 521研究了石榴皮提取物對羥自由清除作用和小鼠肝勻漿脂質過氧化的抑制作用，結果表明，石榴皮中的多酚物質能抗氧化作用明顯，其半抑制濃度IC50，EC50分別0．288mg／mL、O．0079mg／mL。茶多酚能有效滅活體內的自由基，對自由基引起的氧化損傷有很好的防護作用。研究表明，茶多酚能對紫外線引起的人紅細胞溶血及維生素C／Fe2+激發的肝勻漿谷胱甘肽耗竭均有顯著的抑制作用。能保護體外紅細胞、組織谷胱甘肽及DNA免受氧自由基損傷。
1．3．2．3維生素類【54刪】維生素E、維生素c及其衍生物，既是食品營養素，又可作為抗氧化劑。許多 西南大學碩士學位論文水果和蔬菜中富維生素E、維生素C等物質。水溶性維生素C可以協同維生素E抵抗氧自由基，其機理為維生素C消除環境中的氧自由基而保護維生素E，節省維生素E的使用。維生素E是脂溶性小分子抗氧化劑代表性物頃．可以防止細胞膜上的脂質被氧化，否則因其氧化產生的脂褐素會促使細胞衰老，從而影響組織器官的生理功能。蔬菜中的p一胡蘿蔔素或番茄紅素可與過氧化氫自由基反應生成碳自由基而穩定下來。水溶性維生素B族是若干抗氧化酶的輔酶，使抗氧化酶起到清除自由基等抗氧化的作用。
1．3．2．4皂苷類近年來的研究表明，皂苷大多具有明顯的抗氧化作用，皂苷類的抗氧化作用則可能是其延緩衰老、抗動脈粥樣硬化、抗缺血再灌注損傷等藥理作用的共同作用機制。根據苷元的化學結構分為甾體皂苷和三萜皂苷兩類。人參、刺五加、升麻、黃芪中含有萜類皂苷，麥冬、洋地黃、黨參中含有甾類皂苷，這些皂甙均可抑制自由基的形成[ 601。其他具抗氧化活性的皂苷還有三七總皂苷、西洋參皂苷、絞股藍皂苷。柴胡根含皂苷約2％，主要皂苷為柴胡皂苷a、c年l J d，果實亦含多種皂苷。黨參根含三萜類化合物、皂苷、多種甾醇和甾苷等。人參皂苷Rb 1和人參皂苷R93的混合物能阻止神經元產生過量硝酸，延緩衰老。
1．3．2．5其他類現代研究發現，多糖可通過直接清除ROS、絡合產生ROS所必需的金屬離子等途徑實現抗氧化作用。香菇、靈芝、豬苓和木耳等真菌子實體提取的多糖也具有防治癌症的作用，特別是硫酸多糖具有多種生理活性‘。氨基酸和蛋白質在植物體內可以以游離形式存在，更多的是以與多糖、酚類化合物等結合的形式存在，均具有抗氧化活性，單寧．蛋白質複合物也可清除自由基。不飽和脂肪酸、維生素、礦物質等也均為有效的抗氧化成分。
1．4天然抗氧化劑的細胞抗氧化作用的研究進展。
1．4．1細胞抗氧化原理利用螢光探針DCFH—DA檢測細胞內活性氧的變化。用抗氧化劑混合物以及無螢光的DCFH．DA處理肝癌細胞，二者進入細胞後，在細胞酯酶的作用下，DCFH—DA被分解成還原型二氯螢光素( DCFH) 。DCFH不能透過細胞膜到達細胞外。ABAP處理細胞，ABAP進入細胞後自發降解為過氧化自由基形成過氧化自由基，從而誘發細胞產生活性氧。細胞內的DCFH極易被活性氧氧化成螢光物氧化型二氯螢光素( DCH) ，螢光物DCH可通過分光光度法測定。抗氧化劑能夠結 第1章文獻綜述合細胞中的活性氧，從而阻斷有綠色螢光的DCF的生成。細胞螢光物質的減少量就能反映該化合物的抗氧化能力。螢光值越小，抗氧化劑的抗氧化能力越高。
1．4．2天然抗氧化劑的細胞抗氧化能力研究細胞抗氧化測定方法往往通過抗細胞增殖能力來反映其體內抗氧化效果，主要用於食物如果蔬、穀物、豆類和純植物化學物質等的抗氧化活性的評價。果蔬組織內的抗氧化活性成分是當前科學研究的熱點，國外研究者相繼從多種果蔬中提取並鑒定出抗氧化成分，並測定其抗氧化能力。Eberhardt等[ 68-69] 對蘋果抑制Caco一2和HepG一2細胞增殖的能力進行了研究，結果表明，帶皮和去皮的蘋果沸水浸出物質量濃度各為50mg／mL時，對Caco一2的抑制率分別為( 43士1y％和(29士4．1)％，對HepG．2的抑制率分別為(57士0．21)％和(40士0．64)％，說明帶皮蘋果的提取物較去皮蘋果的提取物抑制癌細胞增殖的能力強。常見水果中，蔓越橘、檸檬、蘋果、草莓、葡萄、香蕉、桃子對HepG．2細胞增殖抑制的EC50值依次增加，即抑制細胞增殖的能力依次減弱；常見蔬菜中，菠菜、大白菜、紅辣椒、洋蔥、花椰菜、土豆和甜菜的EC50值依次增加，即抑制HepG一2細胞增殖的能力依次減弱。大量實驗證實，被測物的提取濃度與抑制細胞增殖的能力是存在劑量一效應關係的，提取物濃度越大，抗增殖能力越強。Wol fe等測定了幾十種常見水果蔬菜提取物的抗氧化活性，發現兩種不同處理方法( 不用PBS和用PBS) 鋇4得蘋果的CAA值分別為( 21．9士4．0) “ molQE／1009和(17．2士2．0)p．mol QE／1009，野生藍莓的CAA值分別為( 292士11) I．tmol QE／1009和(74．1士12．5)umol QE／1009。漿果類一般具有較高的CAA值，如野生藍莓、草莓、黑莓、樹莓等，而瓜果類的CAA值較低，如哈密瓜等。蔬菜中則是甜菜、花椰菜和紅辣椒的CAA值較高。CAA值高低與總酚含量是密切相關的。穀物中也含有酚酸類、黃酮類、單寧等酚類化合物，含量和種類與果蔬中的相當，與果蔬不同的是穀物中的酚大多是結合酚，很多實驗都證明穀物如有色稻米等具有抗氧化活性。研究發現，米糠提取物對細胞HL一60和MOL．4的IC50值分別為2．3mg／kg和2．8mg／kg。Hu Chun等【73J 用RAW264．7細胞系證明了深藍色粒小麥的麥麩能使H：02自由基氧化產生的螢光迅速減少，且存在劑量．效應關係。採用CAA方法用於評價純植物化學物質的抗氧化活性時發現：具有3’ ，4’ 一O一二羥基、2，3雙鍵結合。酮基、3．羥基結構的類黃酮具有較高的CAA值；不同純植物化學物質中，槲皮素的CAA值最高，山奈酚、表沒食子兒茶素沒食予酸酯(EGCG)、楊梅酮、木犀草素次之。以wbl fe等的CAA方法以及Honzel 掣7的基於人體血紅細胞的CAP—e方法( cel l ．based anti ．oxi dantprotecti on as—say uti l i si ngerythrocytes) 為基礎，Bl asa等，建立了CAA—RBC方法( cel l ul aranti oxi dantacti vi ty9 西南大學碩士學位論文uti l i si ngredbl oodcel l s) ，用該方法對各種提純的黃酮類物質進行分析，發現異鼠李素、楊梅酮、山奈酚表現出較高細胞抗氧化活性，而木犀草素、EGCG、白藜蘆醇、芹菜素和兒茶素表現出較低活性，與上述CAA方法分析得到的結果有一定差異。此外，CAA方法在豆類、咖啡、茶葉( 茶多酚) 等提取物的細胞抗氧化活性研究中也有應用。
2．1研究目的與意義桑葉是一種藥食兩用的天然植物資源，近年來，桑葉中的營養及功能成分成為國內外研究的熱點，大量研究表明，桑葉中的生物活性物質如多酚類物質、黃酮甙，桑多糖、生物鹼等，在降血糖、降血壓、抗衰老、抗氧化，調節。腎上腺素、降低膽固醇、預防血栓，改善腸道健康，抗癌、抗過敏、防止動脈硬化、利尿等方面具有顯著的功效。我國桑樹資源豐富，而傳統的栽桑養蠶模式單一，桑葉消耗量少，每年有大量的桑葉得不到有效的利用，考慮桑葉具有的功能成分特點，以及我國傳統醫學對桑葉的利用，以及茶飲在我國民間的普及，探索開發桑葉的新用途，將桑葉按照茶葉加工工藝製備加工桑茶，對桑葉利用具有十分重要的意義。中國是人類種茶、制茶、飲茶的發源地，茶文化源遠流長。茶葉作為世界三大飲料之一，廣受全球消費者歡迎，市場對其數量、品質的需求正在逐漸增加與提高，經濟價值巨大。以桑作茶在我國已有一千多年歷史，但我國直到1992年才開始發展桑葉茶，目前國內尚處於技術研究市場開發啟動階段，沒有批量商品上市。隨著人們消費觀念和健康理念的轉變，桑葉茶作為藥食兩用的健康食品，必將越來越被人們所青睞，具有廣闊的市場前景。本研究擬採用藥食兩用資源桑鮮葉為原料，採用茶葉中綠茶加工工藝製備桑茶，特別考慮採用影響綠茶品質的關鍵工藝——殺青，並進行優化處理，來製備目標功能成分含量高及滋味品質好的桑茶，同時針對桑葉富含抗氧化的酚類物質等特點，對製備桑茶抗氧化功能作用進行深入研究，包括體外抗氧化活性和細胞內抗氧化活性，可為研究桑葉茶工藝特點、生物活性成分與其抗氧化活性之問的相關性提供了實驗依據，為桑鮮葉資源的開發利用提供新的思路。考慮桑茶含有的抗氧化成分差異，為此，本實驗在抗氧化活性研究中，考慮了不同溶劑提取對桑葉茶的抗氧化活性的影響，並分別採用了體外抗氧化方法和細胞內抗氧化方法對桑葉茶不同溶劑浸出物的抗氧化能力進行了研究，並對兩種方法的測定結果做了相關性分析，為桑葉茶功能化開發和應用提供有關抗氧化方面的基礎研究資料，有一定的意義。
2．2主要研究內容
不同殺青工藝處理對桑葉茶主要生物活性成分及品質的影響研究殺青是綠茶製備最重要的工序。本部分擬採用綠茶加工工藝中不同殺青工藝 兩南大學碩士學位論文對桑鮮葉進行處理，研究殺青工藝對桑葉茶品質的影響。