編者按
2018年初， 李紅良涉嫌造假問題浮現後， 本刊連續跟蹤報導， 有讀者提醒其發表在《自然醫學》的四篇論文可能還有違反腺相關病毒實驗研究常規方面的問題。 目前， 已有多位AAV基因治療領域專家向《自然醫學》提出質疑。 《知識份子》在此提供相關專家意見， 以便讀者判斷——是否因為李紅良專業知識缺乏， 造成了相關猴子實驗可能存在重大紕漏？如果是， 相關論文結果該作何解釋？同領域專家一看而知的問題， 如果李紅良課題組也清楚， 那麼就進一步提出相關文章可能涉嫌造假。
撰文 | 葉無言
責編 | 李曉明
知識份子為更好的智趣生活 ID：The-Intellectual
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“猴子有AAV8病毒抗體， AAV8不能用於猴子的基因表達；食蟹猴是野生猴， 用於代謝研究背景差異太大， 不可能得出文章中那麼好的結果。 以上問題已有幾位教授向期刊質疑。 ” （舒心梨）
“遇到一個做AAV的資深專家， 談到這個研究， 說大多數猴子（大約九成）因為飼養過程中的感染， 血清內都有抗AAV的抗體， 所以大多數猴子注射AAV之前都需要檢測， 否則完全不會發揮功能。 ”（周家喜）
在本刊登出一系列有關李紅良《自然醫學》論文涉嫌造假的報導後， 有幾位元讀者留言， 提示本刊其猴子實驗可能存在重大紕漏。 這些意見認為， 因為食蟹猴普遍存在抗AAV的抗體， 所以在進行如論文所說的基因治療之前應對猴子進行篩查。
本刊向AAV基因治療領域的兩位國際專家求證（兩位專家分別為：Lili Wang, 賓夕法尼亞大學醫學研究副教授；Haiyan Fu， 美國哥倫布市全國兒童醫院研究所基因治療中心PI。 相關問答請參閱文末）。 綜合兩位專家的意見， 她們一致認為， 在這個案例中， 在猴子實驗之前， 因為AAV在非人靈長類中廣泛存在， 應預先篩查猴子體內是否存在AAV8中和抗體， 只有AAV8中和抗體陰性的動物才可用於實驗。
從2017年至2018年發表的4篇《自然醫學》論文（見文末附錄之2、3、4、5）來看， 李紅良課題組沒有提到曾對實驗猴進行過篩選， 看是否有抗AAV8的抗體；此外， 從本刊獲得的甲乙雙方簽訂的50只猴子的購銷合同看， 李紅良簽字代表的甲方並沒有委託乙方（廣西防城港常春生物技術有限公司）進行過任何AAV抗體的篩查；從此前舉報人霍文哲提供的來自李紅良課題組的50只猴的“實驗猴個體檔案”看，
此外， 兩位專家對於李紅良課題組在猴子實驗7周之後於2016年5月6日進行的AAV8-CFLAR（S1）周圍靜脈注射， “以確保CFLAR（S1）在肝中的穩定表達” 這一做法感到不可理解。
如果確實如李紅良課題組回應的， 在2016年3月17日至26日進行了50只猴子的肝臟門靜脈AAV8注射， 隔了不到兩個月的5月6日再次進行AAV8-CFLAR（S1）注射， 兩位專家認為， 因為第一次注射所產生的抗體， 是不能達到所謂的增強表達的效果的。
有沒有做篩查？又為何要做這樣一個“無意義”的實驗？這些關鍵的實驗環節在論文中沒有體現。
一個可能的情形是， 李紅良課題組不瞭解上述關鍵問題，
據可靠信源， 目前國際上已有多位AAV基因治療領域的專家向《自然醫學》提出質疑。
兩位專家答《知識份子》問
Lili Wang
Research Associate Professor of Medicine， Gene Therapy Program, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Division of Transfusion Medicine, University of Pennsylvania
答：文章中沒有表達轉基因或肽的AAV構建體的相關描述， 比如， 用了什麼啟動子？文章中沒有他們用於生產， 純化和滴定AAV8載體方法的有關描述。 文章中沒有提及他們在任何小鼠或猴子實驗中使用的AAV8載體劑量。 沒有這些資訊， 任何人都難以重複這些資料。
AAV8在猴子中非常流行， 儘管不同群落之間的流行程度可能不同。 AAV預先存在的中和抗體（NAbs）可能影響AAV靜脈遞送（I.V.）的結果。 因此， 對於靜脈遞送實驗， 我們總是預先篩選動物， 看是否有預先存在的中和抗體， 並且對於大多數實驗， 我們僅選擇沒有這些抗體的動物（除非是研究預先存在的中和抗體對轉基因的影響）。 這兩篇論文都沒有提到這一點。 （編者注：此處兩篇論文系附錄中受到質疑的李紅良論文之4、之5， 也即文首報導一中的C文和T文）
問：猴體內的抗AAV8的抗體會影響AAV8載體進入靶細胞，表達其所攜帶的基因麼？這種影響和注射途徑和部位有關麼（如周圍靜脈或肝臟門靜脈）？
答：在AAV領域眾所周知，由於第一次載體注射產生的中和抗體，給已經有免疫活性的動物通過靜脈遞送相同血清型的AAV載體，這樣的重新給藥將不起作用。 這個小組在2017年10月的Nat Med（《自然醫學》）上發表了一份勘誤（參見本文附錄李紅良受質疑論文之1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28985205），他們說在方法部分漏掉了資訊，在猴實驗中，他們第一次注射 AAV8-CFLAR(S1) 7周後，還做了第二次AAV8-CFLAR（S1 ）注射，以確保CFLAR（S1）在肝中的穩定表達。 不知道他們在第二次注射CFLAR（S1）後的表達是不是增加了，可（原則上）這是不可能出現的。
問：即使在沒有抗AAV8抗體的情況下，AAV8載體所攜帶基因的表達有個體差異麼？如果有，差異大麼？
答：是的，即使沒有AAV中和抗體，通常，在基因表達水準上，猴子之間也存在差異。 大型動物的差異通常要大於小鼠這樣的（小型動物）。
Haiyan Fu
Principal Investigator，Center for Gene Therapy, Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, Columbus
答：在非人靈長類使用AAV8進行基因治療：已知AAV在非人靈長類中廣泛存在，因此抗AAV很常見。因此，一般來說，在獲得動物之前，應該進行篩查血清中是否存在相應AAV血清型的抗體，在這個案例中，應該篩查猴子中是否存在AAV8的抗體。通常，只有AAV8中和抗體陰性的動物才可用於實驗, 除非實驗的目的是調查抗AAV抗體對基因治療影響。
問：猴體內的抗AAV8的抗體會影響AAV8載體進入靶細胞，表達其所攜帶的基因麼？這種影響和注射途徑和部位有關麼（如周圍靜脈或肝臟門靜脈）？
答：基於血清裡抗體的水準多少，已經存在AAV8抗體的確會影響AAV8介導的基因遞送的轉導效率。已經存在的AAV抗體對靜脈（常規周圍靜脈或通過門靜脈）遞送的AAV載體的肝臟轉導的影響最大。
問： 該研究組在猴實驗中，在第一次注射 AAV8-CFLAR(S1) 7周後，還做了第二次AAV8-CFLAR（S1 ）注射，以確保CFLAR（S1）在肝中的穩定表達。 一些專家認為，這根本不起作用，不知道為何這樣做，你如何評論？
答：關於該研究組所描述的重新給藥，我同意其他專家的意見，沒什麼意義，因為在第一次注射之後，都會產生很高水準的抗體，因此第二次注射的載體都會被這些抗體清除掉。
問：即使在沒有抗AAV8抗體的情況下，AAV8載體所攜帶基因的表達有個體差異麼？如果有，差異大麼？
答：一般來說，不管哪種AAV血清型，在AAV抗體陰性的動物（包括非人靈長類）中，AAV基因遞送轉導效率都存在個體差異。
附錄：受到質疑的李紅良《自然醫學》論文
1. Wang, P.X., et al. Corrigendum: Targeting CASP8 and FADD-like apoptosis regulator ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and nonhuman primates. Nature medicine 23, 1241 (2017).
2. Ji, Y.X., et al. The deubiquitinating enzyme cylindromatosis mitigates nonalcoholic steatohepatitis. Nature medicine (2018).
3. Zhang, P., et al. The deubiquitinating enzyme TNFAIP3 mediates inactivation of hepatic ASK1 and ameliorates nonalcoholic steatohepatitis. Nature medicine 24, 84-94 (2018).
4. Wang, P.X., et al. Targeting CASP8 and FADD-like apoptosis regulator ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and nonhuman primates. Nature medicine 23, 439-449 (2017).
5. Zhao, G.N., et al. Tmbim1 is a multivesicular body regulator that protects against non-alcoholic
fatty liver disease in mice and monkeys by targeting the lysosomal degradation of Tlr4. Nature medicine 23, 742-752 (2017).
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問：猴體內的抗AAV8的抗體會影響AAV8載體進入靶細胞，表達其所攜帶的基因麼？這種影響和注射途徑和部位有關麼（如周圍靜脈或肝臟門靜脈）？
答：在AAV領域眾所周知，由於第一次載體注射產生的中和抗體，給已經有免疫活性的動物通過靜脈遞送相同血清型的AAV載體，這樣的重新給藥將不起作用。 這個小組在2017年10月的Nat Med（《自然醫學》）上發表了一份勘誤（參見本文附錄李紅良受質疑論文之1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28985205），他們說在方法部分漏掉了資訊，在猴實驗中，他們第一次注射 AAV8-CFLAR(S1) 7周後，還做了第二次AAV8-CFLAR（S1 ）注射，以確保CFLAR（S1）在肝中的穩定表達。 不知道他們在第二次注射CFLAR（S1）後的表達是不是增加了，可（原則上）這是不可能出現的。
問：即使在沒有抗AAV8抗體的情況下，AAV8載體所攜帶基因的表達有個體差異麼？如果有，差異大麼？
答：是的，即使沒有AAV中和抗體，通常，在基因表達水準上，猴子之間也存在差異。 大型動物的差異通常要大於小鼠這樣的（小型動物）。
Haiyan Fu
Principal Investigator，Center for Gene Therapy, Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, Columbus
答：在非人靈長類使用AAV8進行基因治療：已知AAV在非人靈長類中廣泛存在，因此抗AAV很常見。因此，一般來說，在獲得動物之前，應該進行篩查血清中是否存在相應AAV血清型的抗體，在這個案例中，應該篩查猴子中是否存在AAV8的抗體。通常，只有AAV8中和抗體陰性的動物才可用於實驗, 除非實驗的目的是調查抗AAV抗體對基因治療影響。
問：猴體內的抗AAV8的抗體會影響AAV8載體進入靶細胞，表達其所攜帶的基因麼？這種影響和注射途徑和部位有關麼（如周圍靜脈或肝臟門靜脈）？
答：基於血清裡抗體的水準多少，已經存在AAV8抗體的確會影響AAV8介導的基因遞送的轉導效率。已經存在的AAV抗體對靜脈（常規周圍靜脈或通過門靜脈）遞送的AAV載體的肝臟轉導的影響最大。
問： 該研究組在猴實驗中，在第一次注射 AAV8-CFLAR(S1) 7周後，還做了第二次AAV8-CFLAR（S1 ）注射，以確保CFLAR（S1）在肝中的穩定表達。 一些專家認為，這根本不起作用，不知道為何這樣做，你如何評論？
答：關於該研究組所描述的重新給藥，我同意其他專家的意見，沒什麼意義，因為在第一次注射之後，都會產生很高水準的抗體，因此第二次注射的載體都會被這些抗體清除掉。
問：即使在沒有抗AAV8抗體的情況下，AAV8載體所攜帶基因的表達有個體差異麼？如果有，差異大麼？
答：一般來說，不管哪種AAV血清型，在AAV抗體陰性的動物（包括非人靈長類）中，AAV基因遞送轉導效率都存在個體差異。
附錄：受到質疑的李紅良《自然醫學》論文
1. Wang, P.X., et al. Corrigendum: Targeting CASP8 and FADD-like apoptosis regulator ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and nonhuman primates. Nature medicine 23, 1241 (2017).
2. Ji, Y.X., et al. The deubiquitinating enzyme cylindromatosis mitigates nonalcoholic steatohepatitis. Nature medicine (2018).
3. Zhang, P., et al. The deubiquitinating enzyme TNFAIP3 mediates inactivation of hepatic ASK1 and ameliorates nonalcoholic steatohepatitis. Nature medicine 24, 84-94 (2018).
4. Wang, P.X., et al. Targeting CASP8 and FADD-like apoptosis regulator ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and nonhuman primates. Nature medicine 23, 439-449 (2017).
5. Zhao, G.N., et al. Tmbim1 is a multivesicular body regulator that protects against non-alcoholic
fatty liver disease in mice and monkeys by targeting the lysosomal degradation of Tlr4. Nature medicine 23, 742-752 (2017).
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