單抗糖基化調控之參數篇（下）

作者: 知行

關鍵品質參數是單抗仿製藥研發的標杆， 包括糖基化修飾、聚體、電荷異質性等， 其中如糖基化修飾對單抗的生物活性、免疫原性、藥物代謝動力學、構象、穩定性及溶解度具有重要的影響。

細胞培養過程中細胞所處環境， 如pH、溫度、滲透壓、溶氧等參數會影響到單抗糖基化表現， 本文從pH著手就文獻中不同pH設置及調節pH時的 pCO2 水準和不同的堿液對糖基化影響的研究進行了簡要總結。

pH是細胞培養過程中重要的參數之一， 其對細胞生長、蛋白生產及蛋白質量有不容忽視的作用， CO2作為pH調節控制的重要組成部分近年來也慢慢引起了研究人員的重視， 血氣分析儀在細胞培養中的普遍使用也為研究CO2對細胞表現的影響帶來便利。

Brunner的團隊通過新型分離控制策略在CHO細胞中研究了單因素pH(6.8、7.0和7.2)、pCO2(37、94和150 mmHg)、pO2及其交互作用對細胞生長及蛋白質量的影響， 在新型的分離控制策略中pH採用HCL和NaOH進行調節，

pCO2進行離線調控。 在對蛋白N端糖基化分析後發現半乳糖化、唾液酸化和岩藻糖化(G1、S1、aF1)均在一定範圍內變化， G1 25-30%， S1 0.5-1.5%和aF1 4-8%。

如圖1所示， 半乳糖化、唾液酸化和岩藻糖化隨培養參數的改變而變化， 且當pH為7.2時S1和aF1水準最高， 且S1與Man8具有相關性(圖1C)；而G1隨pH和pCO2的變化較為複雜， 當pH為7.2且pCO2為150 mmHg時G1水準最低為21%， 而當pH為6.8且pCO2為150 mmHg時G1水準最高為31%， pH為7.0且pCO2為94 mmHg時G1水準為30%；由此可推斷出當pH和pCO2共同作用于細胞時， pH為主導作用， 且當pCO2達到150 mmHg的高水準時不利於蛋白半乳糖化。 由圖1 D可知， 高甘露糖糖型(M6和M8)與pH和pCO2基本處於正相關的趨勢， 當pH分別為6.8和7.2時M6和M8分別最高。

圖1 pH、pCO2、pO2及其交互作用對蛋白糖基化的影響

(圖表來源於參考文獻1)

上面Matthias的團隊研究得出， 提高pH可以促進唾液酸化水準， 但有學者有的結論恰恰相反。 Ivarsson等在雜交瘤細胞HFN 7.1生產IgG1體系中發現當pH增加時， 半乳糖化(G1)和唾液酸化(S1)會有所降低， 而G0F的水準會增加， 如圖2所示。 且當體系pH從6.8升高到8.0時， G1水準從0.43降低到0.24， S1水準從0.15降低到0.08， 接近50%的降低比例， 而岩藻糖化(F1)水準基本不變(0.99→0.94)(文中資料未體現)。

關於pH變化對糖基化影響的機理， Ivarsson結出的解釋是pH影響了體系中銨離子水準， 進而影響到高爾基體內的糖基轉移酶， 因此影響到糖基化水準。

圖2 不同的pH對IgG1糖基化的影響

(圖表來源於參考文獻2)

不同學者對於pH對蛋白糖基化的影響是不一樣的，

可以說是case-by-case的情況。 Trummer等的實驗結果認為當pH在6.8和7.3之間變化時對EPO-FC唾液酸化幾乎沒有影響。 Muthing等發現培養體系的pH增加會提高IgG3的G2F水準及岩藻糖化。 Yoon等研究結果表明， 提高體系的pH可以降低Epo的唾液酸化水準。

Borys等在CHO體系中研究了pCO2及用於調節pH的堿對蛋白唾液酸化的影響， 實驗過程中採用的pCO2範圍有20-40、40-80及140mmHg， 堿有兩種：碳酸鈉和氫氧化鈉， 並且Borys將唾液酸分成Neu5Ac和Neu5Gc(非人類表達， 但其免疫原性還不明確)兩種進行研究。

在研究pCO2的影響時， 保持體系中的pH在6.85-6.95之間， 且是在D3天或D6天開啟pCO2控制， 使其保持在低(20-40mmHg)、中(40-80mmHg)和高(140mmHg)三個水準， 其對細胞表現及蛋白唾液酸化的影響如圖3所示。 收穫時， 當pCO2控制在20-80 mmHg水準時Neu5Gc含量為0.13， 而當在D3天或D6天將pCO2控制在140mmHg時Neu5Gc含量為0.07。 而Neu5Ac水準隨pCO2的變化並不明顯，低水準pCO2時為0.78，高水準pCO2時為0.75。就總唾液酸水準講，高pCO2時為0.82，低pCO2時為0.91，即維持一定的pH並提高pCO2水準時可以降低蛋白的唾液酸化。Zanghi等學者的研究也表明提高pCO2水準會降低蛋白的唾液酸化，pCO2對唾液化表現不同的影響因素較為複雜，有研究稱當pCO2水準高過110mmHg時對細胞具有毒性，高水準的pCO2可能會影響細胞內的CMAH或NADH水準。

圖3 控制不同的pCO2水準對細胞表現及蛋白唾液酸化的影響

(圖表來源於參考文獻3)

在對採用不同堿調控pH對蛋白唾液酸化的影響中，碳酸鈉(Sodium Carbonate)時較氫氧化鈉(Sodium Hydroxide)對體系滲透壓的影響均低於6%，且pCO2基本均維持在60 mmHg。Borys等發現使用碳酸鈉時較氫氧化鈉的唾液酸化水準高，如圖4所示，不論是Neu5Ac和Neu5Gc水準，當使用碳酸鈉作為堿液時均較氫氧化鈉為堿液時水準高(0.90→0.80、0.15→0.10)，同時當碳酸鈉作為堿液時非唾液酸化水準也有所降低。兩種類似的體系中造成唾液酸含量不同的原因，Borys認為採用碳酸鈉作為堿液時引起唾液酸轉移酶活性的升高，進而促使Neu5Ac和Neu5Gc水準提高，但要具體確定其機制還需更多的實驗研究。

圖4 碳酸鈉和氫氧化鈉調控pH對細胞表現及蛋白唾液酸化的影響

而Neu5Ac水準隨pCO2的變化並不明顯，低水準pCO2時為0.78，高水準pCO2時為0.75。就總唾液酸水準講，高pCO2時為0.82，低pCO2時為0.91，即維持一定的pH並提高pCO2水準時可以降低蛋白的唾液酸化。Zanghi等學者的研究也表明提高pCO2水準會降低蛋白的唾液酸化，pCO2對唾液化表現不同的影響因素較為複雜，有研究稱當pCO2水準高過110mmHg時對細胞具有毒性，高水準的pCO2可能會影響細胞內的CMAH或NADH水準。

圖3 控制不同的pCO2水準對細胞表現及蛋白唾液酸化的影響

(圖表來源於參考文獻3)

在對採用不同堿調控pH對蛋白唾液酸化的影響中，碳酸鈉(Sodium Carbonate)時較氫氧化鈉(Sodium Hydroxide)對體系滲透壓的影響均低於6%，且pCO2基本均維持在60 mmHg。Borys等發現使用碳酸鈉時較氫氧化鈉的唾液酸化水準高，如圖4所示，不論是Neu5Ac和Neu5Gc水準，當使用碳酸鈉作為堿液時均較氫氧化鈉為堿液時水準高(0.90→0.80、0.15→0.10)，同時當碳酸鈉作為堿液時非唾液酸化水準也有所降低。兩種類似的體系中造成唾液酸含量不同的原因，Borys認為採用碳酸鈉作為堿液時引起唾液酸轉移酶活性的升高，進而促使Neu5Ac和Neu5Gc水準提高，但要具體確定其機制還需更多的實驗研究。

圖4 碳酸鈉和氫氧化鈉調控pH對細胞表現及蛋白唾液酸化的影響