作者：蚍蜉玉
一天tRNA急急忙忙找到mRNA告訴他：聽朋友圈裡說課題組核酸界裡多了一個環形的胖子RNA， 功能齊全更重要的是可以編碼蛋白，
那麼今天分析的文章題目是《Extensive translation of circular RNAs driven by N 6 -methyladenosine》（回復170828可下載， 一周有效）。 circRNA主要通過反式剪切內含子而來， 與mRNA相比其可是去了頭又掐了尾， 一個非經典的剪切過程。
有大量的報導研究circRNA可以作為miRNA sponges與miRNA競爭性結合mRNA， 也被稱為ceRNA， 從而調控mRNA的翻譯和表達。 大部分的環狀RNA的生物學功能還未曾可知。 但是一個有趣的觀點是circRNA可以翻譯成蛋白， 編碼蛋白， 那麼就來看看其是如何編碼的吧！
背景知識普及
N6甲基化（m6A）的基本介紹：
（1）m6A 在真核細胞中的表達廣泛。
（2）m6A 腺苷的甲基化被甲基轉移酶複合物（METTL3， METTL14以及Wilms’ tumor 1相關蛋白）所催化；m6A 可以被脂肪、FTO以及AKLBH5去甲基化。
（3）m6A 能夠被YTH家族（YTHDF1, YTHDF12 和YTHDF13）結構域所識別。
（4）含有IRES的環狀RNA可翻譯蛋白，
以下就是文章的主要內容介紹
（一）含m6A 基序的環狀RNA可以被翻譯
第一：含有m6A 基序的環狀RNA能夠表達GFP蛋白。
作者早前的研究工作已經發現含有IRES元件的反向拼接形成的環狀RNA可表達完整的GFP蛋白， 課題組進一步驗證該現象時， 發現一個驚人的結果：其它三個陰性對照組（不含IRES元件）都可以促進GFP的翻譯。 為什麼會出現這個奇怪的現象， 原因是在起始位點附近都包含了RRACH片段， 聚集了m6A 序列。
第二：m6A 最近被發現增加信使rna 的翻譯效率。
研究觀察的結果顯示m6A 聚集的RRACH的序列， 可能捲入到了環狀RNA的起始翻譯過程中。
為了驗證這個假說， 課題組在circRNA報告基因起始密碼子之前插入了含m6A 保守基序不同拷貝數的短片段，
如課題組預想的一樣， 包含一個或者兩個基序的circRNA都翻譯了蛋白， 而且突變的兩個基序明顯減少了GFP的表達量。 另外有一個基序位點的環狀RNA與擁有兩個的基序位點相比有著同樣的翻譯效率， 表明一個基序位點足夠引起翻譯， 而當circRNA插入空白腺苷酸序列的時候， GFP就不表達了。
另外， 課題組也檢測了其它兩種序列RSV 和RSVns， 這兩個序列已經被報導可以被m6A 修飾， 而且這兩種序列可以明顯的增加蛋白翻譯。 更重要的是突變該序列在減少了m6A 的甲基化水準的同時， 也同樣削減了翻譯效率， 進一步證明了m6A 能夠促使環狀RNA翻譯蛋白。
（二）環狀RNA中m6A 表達水準的變化影響著翻譯效率
第一：驗證m6A 序列是否一定要被甲基化才能促使環狀RNA翻譯。
課題組通過m6A 的抗體沉澱了中包含RSV m6A 位點的環狀RNA以及SON mRNA的蛋白， 但是對照組卻不能沉澱下來。 包含m6A 序列突變的環狀RNA也能被m6A 的抗體沉澱下來， 但是翻譯效率急劇下降。
這些結果顯示， 突變能夠減少部分但不能完全消減在RSV 位點上的m6A 的甲基化。
第二：共轉m6A 的去甲基化酶 FTO顯著減少了SON mRNA和circRNA 中GFP的蛋白表達量。
這些都表明具有m6A 位點的circRNA/mRNA是甲基化的， 而且環狀RNA的翻譯需要m6A 的甲基化。
第三：共轉m6A 的甲基轉移酶METTL3/14可以顯著增加 RNA-IP的信號。
在具有m6A基序的環狀RNA組和mRNA組中， 而在對照組中是沒有增加的。 同時， 環狀RNA組中， 也顯示增加了蛋白的翻譯水準。
有趣的是， 當單獨轉染METTL14 時效果是不穩定的， 但是當共轉METTL3/14時不僅穩定了METTL14而且也誘導了GFP蛋白的翻譯， 這也可能提供了一個資訊：METTL3/14很可能形成了一個複合物。
課題組還發現 FTO 或者 METTL3/14的表達不能夠改變環狀RNA的水準， 表明m6A 的修飾對環狀RNA的穩定性不影響。 這個觀察結果與之前報導的m6A 的修飾促進線性RNA的降解不同， 這也從側面反映了環狀RNA有很好地穩固性，m6A 的修飾帶來的小的不穩定不明顯或者環狀RNA的降解與線性RNA的機制不同。
（三）m6A 促使環狀RNA的翻譯需要哪些蛋白因數的參與
第一：m6A 能夠促進環狀RNA的翻譯需要蛋白因數eIF4G2的參與。
課題組使用穩定的細胞系表達兩種eIF4G2的干擾RNA，而後在環狀RNA和線性RNA中分別檢測編碼蛋白GFP的情況。
如所想的一樣，eIF4G2敲除的顯著減少了環狀RNA翻譯成蛋白，但是對線性RNA生成蛋白不影響。同樣的，去除eIF3A時，eIF3A是eIF3的一個亞基，可與病毒IRES相結合，能夠顯著減少環狀RNA對蛋白的翻譯但是對線性RNA沒有影響。
第二：課題組探索識別m6A 的蛋白是否是環狀RNA翻譯蛋白的必須蛋白。
課題組發現通過RNAi技術在環狀RNA和線性RNA中都敲除YTHDF1後不能夠影響翻譯成蛋白，而且YTHDF2敲除後輕度的抑制了GFP蛋白的生成，然而敲除YTHDF3後顯著的抑制了環狀RNA中GFP蛋白的生成而對線性RNA沒有影響，表明YTHDF3是m6A促使環狀RNA起始翻譯的識別蛋白。
而且通過CO-IP分析YTHDF3可以與eIF4G2相互結合，YTHDF3招募eIF4G2促使m6A翻譯蛋白。
以上實驗部分已經做了豐富的驗證，那麼接下來就是電腦的事了
（四）識別內源性含m6A 基序修飾的環狀RNA
為了評估細胞中的環狀RNA m6A 修飾調節的重要性，課題組進行了測序，並且通過m6A -IP鑒定出13%總環狀RNA具有m6A修飾特性。
（五）評估編碼蛋白環狀RNA在人類基因組中的表達情況
第一：根據以上的觀察，課題組開發了一個電腦通道去預測內源性可翻譯的環狀RNA。
首先在Hs68細胞系中通過耐RNase R性質篩選7771個環狀RNA，第一次課題組就篩選出了623個環狀RNA 包含m6A 峰值。再用pre-mapped TIS技術又一次篩選出124個環狀RNA。最後課題組應用了一個任意長度的開放閱讀框進行篩選，篩選出25個環狀RNA。在25個環狀RNA中與核糖體有關係的。
第二：以上的這些結果促使課題組驗證這些具有翻譯性質的環狀RNA在人基因組資訊中的匹配資訊。
首先用梯度離心純化出多蛋白體相關的RNAs，然後將樣本用RNaseR消化處理後進行高通量測序。篩選出了250個與多蛋白體相關的環狀RNA，只有二十五分之一可翻譯的環狀RNA被預測到，可能是因為實驗方法尚有不足。
當與所有的環狀RNA做比較時，發現多蛋白體相關的環狀RNA有很少的外顯子組成而且基本上都很短；但是具有較長的開放閱讀框，這一點與預想的編碼蛋白一致。
第三：課題組將單體和多蛋白體相關的環狀RNA用螢光定量PCR技術去驗證，所選的7個環狀RNA是已經確認與核糖體相關。
以上這些結果表明，包含m6A 並具有編碼蛋白功能的環狀RNA在人類基因組中是廣泛分佈。
（六）質譜分析環狀RNA翻譯的肽段
為了直接驗證環狀RNA編碼的內源性蛋白，課題組設計了一個資料庫，該資料庫包含測序分析出的反式剪切的環狀RNA的肽段，而且將這些肽段與蛋白資料庫聯繫起來。結果課題組篩選出33個肽段，但是與蛋白資料庫匹配的不是很多。
為了更深一步探索候選的環狀RNA編碼的肽段，課題組使用化學方法人工合成候選環狀RNA編碼的肽段然後去進行質譜分析。
結果發現有兩個合成的環狀RNA的肽段與原始的肽段相匹配，表明經過蛋白質組學鑒定的肽段可能是產生於環狀RNA的翻譯。這些肽段僅僅是環狀RNA編碼蛋白質組的一小撮，因為只有肽段測序到反式剪接相連才是環狀RNA編碼的產物。
如果你覺得文中內容太多，那看看作者嘔心瀝血作的m6A 促使環狀RNA翻譯的模式圖吧！如下：
m6A 促使的起始翻譯需要起始轉錄因數eIF4G2和m6A 閱讀器YTHDF3的參與，增強翻譯的是甲基轉移酶METTL3/14，抑制翻譯的是去甲基化酶 FTO。
這也從側面反映了環狀RNA有很好地穩固性，m6A 的修飾帶來的小的不穩定不明顯或者環狀RNA的降解與線性RNA的機制不同。（三）m6A 促使環狀RNA的翻譯需要哪些蛋白因數的參與
第一：m6A 能夠促進環狀RNA的翻譯需要蛋白因數eIF4G2的參與。
課題組使用穩定的細胞系表達兩種eIF4G2的干擾RNA，而後在環狀RNA和線性RNA中分別檢測編碼蛋白GFP的情況。
如所想的一樣，eIF4G2敲除的顯著減少了環狀RNA翻譯成蛋白，但是對線性RNA生成蛋白不影響。同樣的，去除eIF3A時，eIF3A是eIF3的一個亞基，可與病毒IRES相結合，能夠顯著減少環狀RNA對蛋白的翻譯但是對線性RNA沒有影響。
第二：課題組探索識別m6A 的蛋白是否是環狀RNA翻譯蛋白的必須蛋白。
課題組發現通過RNAi技術在環狀RNA和線性RNA中都敲除YTHDF1後不能夠影響翻譯成蛋白，而且YTHDF2敲除後輕度的抑制了GFP蛋白的生成，然而敲除YTHDF3後顯著的抑制了環狀RNA中GFP蛋白的生成而對線性RNA沒有影響，表明YTHDF3是m6A促使環狀RNA起始翻譯的識別蛋白。
而且通過CO-IP分析YTHDF3可以與eIF4G2相互結合，YTHDF3招募eIF4G2促使m6A翻譯蛋白。
以上實驗部分已經做了豐富的驗證，那麼接下來就是電腦的事了
（四）識別內源性含m6A 基序修飾的環狀RNA
為了評估細胞中的環狀RNA m6A 修飾調節的重要性，課題組進行了測序，並且通過m6A -IP鑒定出13%總環狀RNA具有m6A修飾特性。
（五）評估編碼蛋白環狀RNA在人類基因組中的表達情況
第一：根據以上的觀察，課題組開發了一個電腦通道去預測內源性可翻譯的環狀RNA。
首先在Hs68細胞系中通過耐RNase R性質篩選7771個環狀RNA，第一次課題組就篩選出了623個環狀RNA 包含m6A 峰值。再用pre-mapped TIS技術又一次篩選出124個環狀RNA。最後課題組應用了一個任意長度的開放閱讀框進行篩選，篩選出25個環狀RNA。在25個環狀RNA中與核糖體有關係的。
第二：以上的這些結果促使課題組驗證這些具有翻譯性質的環狀RNA在人基因組資訊中的匹配資訊。
首先用梯度離心純化出多蛋白體相關的RNAs，然後將樣本用RNaseR消化處理後進行高通量測序。篩選出了250個與多蛋白體相關的環狀RNA，只有二十五分之一可翻譯的環狀RNA被預測到，可能是因為實驗方法尚有不足。
當與所有的環狀RNA做比較時，發現多蛋白體相關的環狀RNA有很少的外顯子組成而且基本上都很短；但是具有較長的開放閱讀框，這一點與預想的編碼蛋白一致。
第三：課題組將單體和多蛋白體相關的環狀RNA用螢光定量PCR技術去驗證，所選的7個環狀RNA是已經確認與核糖體相關。
以上這些結果表明，包含m6A 並具有編碼蛋白功能的環狀RNA在人類基因組中是廣泛分佈。
（六）質譜分析環狀RNA翻譯的肽段
為了直接驗證環狀RNA編碼的內源性蛋白，課題組設計了一個資料庫，該資料庫包含測序分析出的反式剪切的環狀RNA的肽段，而且將這些肽段與蛋白資料庫聯繫起來。結果課題組篩選出33個肽段，但是與蛋白資料庫匹配的不是很多。
為了更深一步探索候選的環狀RNA編碼的肽段，課題組使用化學方法人工合成候選環狀RNA編碼的肽段然後去進行質譜分析。
結果發現有兩個合成的環狀RNA的肽段與原始的肽段相匹配，表明經過蛋白質組學鑒定的肽段可能是產生於環狀RNA的翻譯。這些肽段僅僅是環狀RNA編碼蛋白質組的一小撮，因為只有肽段測序到反式剪接相連才是環狀RNA編碼的產物。
如果你覺得文中內容太多，那看看作者嘔心瀝血作的m6A 促使環狀RNA翻譯的模式圖吧！如下：
m6A 促使的起始翻譯需要起始轉錄因數eIF4G2和m6A 閱讀器YTHDF3的參與，增強翻譯的是甲基轉移酶METTL3/14，抑制翻譯的是去甲基化酶 FTO。