角膜移植免疫排斥反應的細胞治療的研究進展

羅丹綜述趙敏審校

400016 重慶醫科大學附屬第一醫院眼科重慶市眼科研究所眼科學重慶市重點實驗室

通信作者：趙敏

Email：minzhao2002@163.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2017.09.016

基金專案：國家自然科學基金專案（81170822）

【摘要】角膜移植術後免疫排斥反應是導致手術失敗的主要原因，而臨床上常用的免疫抑制劑存在著許多不良反應。近年來，細胞治療效果確切、不良反應少等原因已成為新的研究熱點。大量研究表明，在誘導、維持機體免疫耐受和免疫應答穩態方面有重要作用的調節性T細胞能直接參與角膜移植術後的免疫耐受的形成。

近年來，樹突狀細胞被發現在免疫系統中有著雙重角色，除作為抗原提呈細胞誘發免疫反應外，不成熟或表達抑制性細胞因數的樹突狀細胞還可誘導免疫耐受。體內外研究表明，間充質幹細胞作為是一種具有多向分化潛能的非造血基質細胞，可通過對免疫細胞的影響，誘導抗炎效應和/或免疫耐受狀態，有效抑制器官移植排斥反應。而作為繼Tregs之後的又一熱點細胞，髓源性抑制細胞能由多種途徑抑制效應性T細胞增生，減少細胞因數的分泌，促進T細胞凋亡，抑制B細胞、NK細胞和巨噬細胞等的活動，甚至能誘導Tregs的產生，在抑制自身免疫性疾病和器官移植排斥中起著重要的作用。本文就以上4種細胞的免疫特點，

以及它們在角膜移植排斥反應治療方面的實驗研究進展進行綜述。

【關鍵字】角膜移植；排斥反應；細胞治療

角膜盲是世界第二大致盲眼病，發病率僅次於白內障，而角膜移植手術是目前治療角膜盲患者唯一有效的方法。移植術後免疫排斥反應是角膜移植手術失敗的主要原因，因此如何提高植片存活率成為目前眼科臨床亟需解決的問題。近年來，細胞治療逐漸成為研究的新熱點，現將角膜移植免疫排斥反應細胞治療的研究近況作一綜述。

調節性T細胞

1.1 調節性T細胞的基本作用

CD4+CD25+T調節性細胞（regulatory T cells， Tregs）是CD4+T細胞的重要亞群，在人類和鼠類的胸腺、淋巴組織和外周血中，占CD4+T細胞的5％～10％。 Tregs可以抑制免疫系統對自身和外來抗原的應答，

在誘導、維持機體免疫耐受和免疫應答穩態方面具有十分重要的作用[1]。目前認為Tregs主要通過以下途徑發揮其免疫抑制功能：（1）細胞間的直接接觸 Tregs通過細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）和轉化生長因數-β （transforming growth factor-β， TGF-β）與效應性T細胞（effector T cells， Teff）相應配體結合，抑制Teff細胞的信號通路，減少白細胞介素（interleukin， IL）-2等細胞因數的分泌；（2）樹突狀細胞的間接抑制途徑[2]Tregs通過下調抗原遞呈細胞（antigen presenting cell， APC）表面分子（CD80、CD86和CD40等）的表達，抑制APC對Teff的抗原遞呈與活化作用；（3）細胞因數途徑分泌具有抑制作用的細胞因數，如IL-10、TGF-β等；（4）細胞溶解途徑 Tregs通過釋放穿孔素和顆粒蛋白酶，使靶細胞死亡。

1.2 Tregs在角膜移植免疫中的作用

Tregs誘導的免疫耐受是移植物長期存活的重要機制之一，近年來的研究證實，

該細胞在移植免疫領域有十分重要的意義。研究表明， Tregs可參與眼局部免疫微環境的穩定調節，在角膜移植免疫排斥反應中發揮著重要作用。 Chauhan等[3]在小鼠同種異體角膜移植術後，通過研究術後未發生移植排斥小鼠與發生排斥小鼠的植片和局部引流淋巴結內Tregs的數量及功能是否存在差異，證實Foxp3+Tregs在眼局部參與了角膜移植術後免疫耐受的形成。同時， Western blot法和PCR法檢測表明，未排斥小鼠的Tregs中Foxp3蛋白和mRNA水平均高於排斥小鼠，推測眼部引流淋巴結Tregs中Foxp3的表達情況與免疫耐受程度相關，高表達Foxp3的Tregs具有更強的免疫抑制功能。

1.3 Tregs在角膜移植中的治療應用

多年來，國內外許多研究者都試圖找到合適的藥物來治療或減輕角膜移植術後排斥反應，

其中部分藥物可通過增加Tregs達到一定的治療效果。 Zhu等[4]通過每天給予角膜移植術後的小鼠S1P1滴眼劑，發現給藥組角膜植片的存活時間明顯延長。 S1P1可選擇性地作用于外周淋巴細胞，促進其向周圍淋巴器官歸巢，抑制T細胞從胸腺向外周血釋放，同時，可增加Tregs在眼部淋巴結和脾臟中的分佈，達到抗排斥的效果。 Wang等[5]研究發現，術後聯合給予角膜移植術後的小鼠全反式維甲酸和TGF-β有利於誘導免疫耐受，術後排斥率顯著降低，推測此效應可能與打破Th17-Treg的平衡、促進Treg分化有關。研究結果顯示，全反式維甲酸聯合TGF-β治療後，小鼠外周血、脾臟和引流淋巴結中的Tregs均增加， Foxp3的表達也增強。

近年來有研究者將目光投向不良反應更小、效果更直接的細胞治療。 Guo等[6]從正常小鼠分離出自然調節性T細胞（nTreg），在體外使其擴增出數量較大的適應性調節性T細胞（iTreg）。體外檢測顯示，iTregs抑制Teff的功能強於nTregs，將這些iTregs由尾靜脈輸注給角膜移植術小鼠後，角膜植片的存活時間明顯延長。研究還發現，輸注的iTregs更易於遷移至眼部引流淋巴結和脾臟，從而發揮其誘導、維持免疫耐受和免疫應答穩態的作用。Tregs的給予途徑對免疫耐受的形成有重要影響，Hildebrand等[7]遂由尾靜脈和結膜下2條途徑給不同年齡（3周齡和10周齡）角膜移植術後的大鼠注射初始調節性T細胞（naïve Tregs），結果發現結膜下注射Tregs的幼年大鼠術後排斥率降低了66.7%、成年大鼠降低了33.3%，而尾靜脈注射法無明顯效果。推測其原因可能是，由尾靜脈注射的Treg被血液稀釋，最終遷移至眼部的數量太少，難以有效地發揮作用。

樹突狀細胞

2.1 樹突狀細胞的基本作用

樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是目前已知的機體內功能最強的APC，也是活化初始CD4+T細胞最有效的APC。未成熟DCs具有較強的遷移能力，但刺激初始T細胞活化的能力很弱，而成熟DCs能有效啟動初始型T細胞，對免疫反應的啟動、調控、應答環節起重要作用。

2.2 DCs在角膜移植免疫中的作用

移植排斥反應中，DCs等APC將供體抗原遞呈給受體特異性的T淋巴細胞，輔助性T細胞在第一信號（APC遞呈的異體抗原）和第二信號[APC分泌的非特異性因數，如IL-2、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4]的作用下被啟動，誘發遲髮型超敏反應（delayed type hypersensitivity，DTH）。近年來，DCs被發現在免疫系統中扮演著雙重角色，除作為APC誘發免疫反應外，還能誘導中樞或周圍性免疫耐受。利用不成熟或表達抑制性細胞因數的DCs誘導免疫耐受為治療角膜移植排斥反應提供了新的策略[8-9]。

2.3 DCs在角膜移植中的治療應用

Hattori等[10]應用小鼠同種異體角膜移植模型研究供體來源、免疫耐受的DCs能否抑制免疫排斥的間接識別通路，發現受體在供體骨髓來源的調節性DCs（DCreg）作用下能夠生成大量粒細胞-巨噬細胞集落刺激因數（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF），IL-10和TGF-β1，植片的存活時間顯著延長，證明此類DCs可顯著抑制免疫排斥間接識別通路，從而使移植細胞無法識別而啟動排斥機制。Khan等[11]通過2種方法修飾DCs後，將其應用於小鼠角膜移植模型，結果表明表達CTLA4-KDEL的DCs可顯著降低CD80/86的表達，抑制同種異體T細胞增生，促使Tregs生成，角膜植片得以長期存活，證明了DCs修飾是一種潛在可行的誘導臨床移植免疫耐受的方法。Li等[12]研究發現，IL-10修飾後DCs的主要組織相容性複合體Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）、CD80、CD86的表達均下調，並維持於不成熟狀態，進而移植物的存活時間明顯延長。還有許多研究應用其他具有抗炎作用或免疫抑制效應的化學物修飾DCs，如TGF-β1、前列腺素E2、組胺和維生素D3[13]，也取得了一定的成果。

修飾的方法也是多種多樣，除了採用基因轉染，還有免疫抑制劑預處理，包括糖皮質激素、環孢素、FK506、黴酚酸酯，以改變DCs的分化和功能[14]。如雷帕黴素處理後的受體來源的DCs被同種異體抗原刺激後，MHC和共刺激分子（尤其是CD86）的表達降低，還能促使受體的Foxp3+ Tregs數量增加[15]。

間充質幹細胞

3.1間充質幹細胞的基本作用

間充質幹細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的非造血基質細胞[16]，可通過對免疫細胞的影響，誘導抗炎效應和/或免疫耐受狀態。體內外研究表明，MSCs能抑制T細胞的增生與活化。原因可能是MSCs可下調活化T細胞的IL-2受體的表達[17]，也可能與IL-10、TGF-β、肝細胞生長因數、吲哚-2，3雙加氧酶（IDO）、一氧化氮（nitric oxide，NO）及前列腺素E2等因數有關。對於DCs，MSCs能下調其表面分子（CD40、CD80、CD83和CD86）的表達[18]。

3.2 MSCs在角膜移植中的治療應用

動物模型中MSCs相繼應用於皮膚移植、腎移植和肝臟移植等的研究。研究表明，MSCs能夠有效抑制器官移植排斥反應。近年來，MSCs在角膜疾病方面也得到一定的重視，目前MSCs已經應用於角膜移植排斥模型，探討其在角膜移植免疫排斥反應中的作用。

Treacy等[19]在大鼠角膜移植模型中，於術前7 d和手術當天經尾靜脈注射3種不同來源的MSCs，分別為同基因、同種異基因和協力廠商基因來源，發現後2種來源的MSCs可以將術後植片的存活率從20%分別增至90%和80%。研究發現，這2個組大鼠角膜植片的自然殺傷T細胞浸潤較對照組減少，脾臟內Tregs增加，且Foxp3的表達水準也較對照組增加。此研究證實，同種異基因和協力廠商基因來源的MSCs可以降低角膜供體抗原的高致敏性，改變移植物內的免疫調節微環境，從而減弱DTH，顯著延長同種異基因角膜植片的存活。Oh等[20]發現由尾靜脈注射人源MSCs（human MSCs，hMSCs）能夠減弱術後早期的炎症，延長移植物的存活時間。PCR法和ELISA法檢測表明，實驗組術後早期IL-2、IL-1和IL-12a的表達下降，術後28 d IL-2、IFN-γ、顆粒酶B和穿孔素表達減低，眼部引流淋巴結內成熟DCs的比例也降低，證明hMSCs可以抑制APC的功能。結果還顯示hMSCs降低早期炎症反應的機制主要與腫瘤壞死因數刺激基因／蛋白-6（TSG-6）抗炎因數的分泌有關。TSG-6能降低角膜的混濁及新生血管化程度，同時減少角膜炎性細胞的浸潤，並使促炎因數、趨化因數及促新生血管因數的表達下降。類似地，Omoto等[21]研究發現，尾靜脈給予的同基因MSCs能遷移到移植術後的角膜、結膜和淋巴結，促使植片和淋巴結中成熟MHCⅡ+CD11+APC和分泌IFN-γ的Th1細胞明顯減少，從而抑制對同種異基因抗原的免疫應答。

研究發現，經全身輸入的MSCs會不可避免地被肺部截留[22]，這也在一定程度上限制了靜脈注射的MSCs向其他部位的遷移效率，另外，尾靜脈輸注MSCs的需求量較大且存在一定的全身不良反應。李斐等[23]通過在大鼠角膜移植模型局部應用MSCs，發現結膜下注射MSCs顯著延長大鼠異體穿透角膜移植術後植片的存活時間，結果顯示植片內IFN-γ、IL-2表達降低，IL-4、IL-10表達升高，推測可能與Thl/Th2應答平衡發生改變有關[24]。

髓源性抑制細胞

4.1 MDSCs的基本作用

20世紀80年代在腫瘤患者體內發現了一群具有抑制效應的髓系來源細胞, 即髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）[25]。MDSCs為一群形態和功能多樣化的細胞，由巨噬細胞、粒細胞、DCs和未成熟骨髓細胞（immature myeloid cells，IMCs）的祖細胞組成[26-27]。正常情況下，IMCs遷移至不同的外周器官分化為巨噬細胞、粒細胞和DCs。在病理條件下，某些因素能抑制IMCs的聚集，阻滯其正常分化，使之成為具有顯著抑制功能的一類天然免疫細胞。MDSCs在小鼠中表達為Gr-1+（Ly-6G）和CD11b+，在人體中主要表達為CD33+和CD14+。MDSCs能由多種途徑抑制Teff增生，減少細胞因數的分泌，促進T細胞凋亡，甚至能誘導Tregs的產生。此外，MDSC還可以抑制B細胞、NK細胞和巨噬細胞等的活動[28]。MDSCs在抑制自身免疫性疾病[29]和器官移植排斥中起重要作用，是移植免疫學領域中繼Tregs之後的又一熱點細胞。

4.2 MDSCs在移植免疫中的作用

Dugast等[30]率先在大鼠腎移植模型中發現，應用抗CD28抗體誘導免疫耐受大鼠外周血中的CD11b+髓性細胞，即MDSCs細胞數增加。他們用混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction，MLR）等體外檢測後發現MDSCs可以通過細胞接觸的方式誘導Teff凋亡，推測MDSCs的抑制功能與對誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）調控有關；抑制iNOS的活性，可以打破已經建立的免疫耐受。Nakamura等[31]通過給予小鼠心臟移植模型腹腔內注射3 mg/kg雷帕黴素，發現表達iNOS的MDSCs數量增加，並在移植後的心臟血管內膜下聚集，移植物的存活時間顯著增加。此外，在皮膚移植模型中，地塞米松和環孢素A也被發現能促使移植物、脾臟、外周血和骨髓中的MDSCs數量增加[32]。由這些研究推測，MDSCs的增加可能是某些免疫抑制劑發揮免疫調節作用的途徑之一。

Dugast等[30]嘗試給予腎移植術後的大鼠中直接注射 MDSCs，但免疫排斥並未得到改善，猜想MDSCs的免疫抑制作用必須依靠細胞間的接觸，輸入的MDSCs必須到達發生免疫致敏、免疫應答的部位才能夠發揮作用[31]。隨後發現，穿過血管注射MDSCs使其直接注入移植心臟的冠狀動脈中，這種方法成功地提高了移植物的存活率。

4.3 MDSCs在角膜移植的治療應用

Han等[33]將膿毒症模型中分離得到的CD11b+Gr-1+細胞應用於小鼠角膜移植模型，發現植片存活時間延長。He等[34]在小鼠角膜移植術後，由眶後注射3種不同來源的MDSCs，分別為初始骨髓細胞（naive myeloid cells，nMCs）、炎症誘導的MDSCs（inflammation-induced MDSCs，iMDSCs）和腫瘤誘導的MDSCs（tumor-induced MDSCs，tMDSCs）。iMDSCs和tMDSCs都能顯著的抑制角膜新生血管的形成，減少炎性細胞在植片的浸潤，在沒有使用免疫抑制劑的情況下，明顯延長了植片存活時間。同時他們提到由於粒細胞特性，iMDSCs的壽命僅數天，而這一點可以極大地減輕長期免疫抑制的不良反應。

展望

目前，對於角膜移植後免疫排斥的治療研究較多，但臨床上藥物治療仍然是首選，且局部或全身的藥物不良反應越來越多。隨著人們對免疫排斥發生機制的深入研究，更多的治療方法受到關注。近來已有臨床試驗專案試圖通過給予腎移植術後的患者輸注自身單核細胞來源的耐受性DCs聯合使用更小劑量的免疫抑制劑，探索這種新治療方案的安全性和臨床效果[35]。雖然目前細胞治療研究仍主要處於實驗階段，但相信隨著細胞生物學等學科的發展，細胞治療的研究也會在給藥途徑、給藥時間及聯合用藥等方面得到進一步的突破，最終能運用於臨床造福人類。

參考文獻（略）

Guo等[6]從正常小鼠分離出自然調節性T細胞（nTreg），在體外使其擴增出數量較大的適應性調節性T細胞（iTreg）。體外檢測顯示，iTregs抑制Teff的功能強於nTregs，將這些iTregs由尾靜脈輸注給角膜移植術小鼠後，角膜植片的存活時間明顯延長。研究還發現，輸注的iTregs更易於遷移至眼部引流淋巴結和脾臟，從而發揮其誘導、維持免疫耐受和免疫應答穩態的作用。Tregs的給予途徑對免疫耐受的形成有重要影響，Hildebrand等[7]遂由尾靜脈和結膜下2條途徑給不同年齡（3周齡和10周齡）角膜移植術後的大鼠注射初始調節性T細胞（naïve Tregs），結果發現結膜下注射Tregs的幼年大鼠術後排斥率降低了66.7%、成年大鼠降低了33.3%，而尾靜脈注射法無明顯效果。推測其原因可能是，由尾靜脈注射的Treg被血液稀釋，最終遷移至眼部的數量太少，難以有效地發揮作用。