作者：蚍蜉玉
miRNA是由Victor Ambros,Gary Ruvkun兩位科學家發現， 主要參與轉錄後調控。 關於小RNA的研究已經越來越火熱， Pubmed記錄2007年只有898篇文章， 而10年後2017年就已經有了12891篇文章。
小RNA的研究範圍不再僅僅是腫瘤的mark， 今日小編科普一下小RNA與明星分子mTOR信號通路之間的套路， 它們首次搭配會產生什麼樣的火花。
《miR-181a Participates in Contextual Fear Memory Formation Via Activating mTOR Signaling Pathway》（回復171009可下載， 一周有效）miR-181a 參與到恐懼記憶的形成是通過啟動mTOR信號途徑。
根據題目資訊， 回顧一下以往microRNA的套路， 參與轉錄後調控因此必須要有靶mRNA與其結合；mTOR的信號通道途徑套路， 必須是與mTOR信號蛋白相關。
那就跟著小編快來看看作者是如何一步一步驗證的吧！
1
小鼠恐懼條件反射訓練1h後， 觀察海馬中miR-181a 的表達水準升高
第一：檢測恐懼反射記憶是否與miR-181a的表達水準相關
恐懼條件反射訓練（CFC）分別是1h和6h後， qPCR技術檢測海馬中miR-181a 的表達水準。 結果發現海馬中miR-181a 的表達水準在恐懼條件反射訓練1h時比6h高，
第二：課題組為了檢測出恐懼反射記憶訓練誘導miR-181a的變化對恐懼記憶的學習是特異的， 因此在CFC訓練或者是電休克的時候也檢測了miR-181a的水準變化。
結果表明不管是電休克或者CFC訓練都不能上調miR-181a的表達水準1b。 表明miR-181a的變化對海馬記憶的學習是特異性的。
第三， 更有趣的是， 杏仁核是腦內記憶形成區， 但是miR-181a的水準卻在CFC訓練後沒有顯著的變化。
綜上所述， CFC訓練能夠提高小鼠海馬中miR-181a的表達水準。
2
在海馬中調控miR-181a的表達水準時會不會影響恐懼記憶的鞏固
第一：課題組在大鼠海馬中的DG區域內注射miR-181a 抑制劑， 敲減miR-181a ， 並且用生物素標記， 1周後， qPCR結果顯示 miR-181a水準下降了60%。 ；同時， 在大鼠DG區域內注射miR-181a 過表達慢病毒，
綜上所述：miR-181a 抑制劑抑制以後顯著降低了海馬內miR-181a的表達水準；miR-181a 過表達慢病毒注射以後顯著增加了海馬內miR-181a 的表達水準。
第二：接下來課題組檢測miR-181a敲除後對海馬依賴性記憶的影響。 課題組分為scramble組和miR-181a拮抗組進行檢測。 結果發現0.7MA電休克後兩組對CFC訓練都沒有效果。 表明miR-181a 敲除對恐懼記憶獲取沒有影響。
第三：我們又檢測了CFC訓練1後短期記憶 （STM）和24h長期記憶（LTM 1）的水準。 結果發現短期記憶中0.7MA電休克後在兩組凍結時間沒有明顯的差距；LTM實驗中， antagomir組冰凍時間相對scramble 組較短， 表明阻止miR-181a損害了恐懼記憶的鞏固。
美膩膩的分割線。 。 。 。 。 。 。 以上已經發現了miR-181a對於恐懼記憶的形成和鞏固有重要的作用的現象， 那接下來就是要探索機制了。
3
PRKAA1和 REDD1是miR-181a的靶向目標
課題組的目標是確定miR-181a調節的靶向目標與海馬記憶相關。
通過Targetscan,miR-22, miRDB, microcosm計算方法， 預測與 miR-181a相結合的mRNAs的3′UTR位點區：PRKAA1和 REDD1是mTOR的信號通路蛋白能夠被miR-181a所調節。
第一：用螢光素酶報告基因檢測PRKAA1和 REDD1的3′UTR區與miR-181a相結合。 在293T細胞中共轉PRKAA1和 REDD1 3′UTR螢光質粒和miR-181a質粒， 螢光素酶調節的螢光素顯著下降；但是PRKAA1和 REDD13′UTR區突變後， 其螢光素酶沒有變化。
這些結果顯示miR-181a與PRKAA1和 REDD13′UTR區結合後抑制了螢光活性；當用antagomirs抑制劑抑制 miR-181a的功能時， 螢光活性恢復正常。 這些結果表明miR-181a與PRKAA1和REDD1相結合。
4
小鼠經過CFC訓練後， 並且在miR-181a的誘導下PRKAA1和REDD1的蛋白水準下降
首先觀察CFC訓練是否與PRKAA1和REDD1蛋白水準相關。
第一：CFC訓練小鼠4h後， PRKAA1和REDD1的蛋白水準下降;
第二：經過CFC訓練後， 是否對mTOR磷酸影響。
其次， 根據以上這些結果， 作者提出疑問是否PRKAA1和REDD1的蛋白水準變化以及mTOR磷酸化水準的變化與miR-181a相關。
第一：作者將小鼠分為四組HC + veh, HC + anta, CFC + veh, and CFC + anta， 結果發現：
抑制了miR-181a後， PRKAA1和REDD1的蛋白水準在miR-181a拮抗劑組高於載體對照組， 表明阻止了miR-181a能夠顯著增加PRKAA1和REDD1的蛋白水準；
CFC + veh組比 HC + veh組高， 表明在CFC訓練4h以後PRKAA1和REDD1的蛋白水準高；
然而， 當antagomir注射以後， CFC+anta組PRKAA1和REDD1的蛋白水準比CFC + veh組水準高；
這些結果表明CFC訓練後PRKAA1和REDD1的蛋白水準的下降時由miR-181a所調節的。
第二：已經發現PRKAA1和REDD1的蛋白水準的下降是由miR-181a所調節， 那麼需要檢測 mTOR的活性變化， 結果發現：
mTOR活性分別在拮抗miR-181a組中下降和經過記憶訓練CFC組中升高；當注射miR-181a拮抗劑以後， CFC+anta組mTOR活性比CFC + veh組水準較低。
這些結果表明 CFC訓練4h以後mTOR的活性是由miR-181a所調節。
綜上所述，miR-181a能夠減少PRKAA1和REDD1的蛋白水準和增加 mTOR活性水準的變化。
5
miR-181a 能夠在經過CFC訓練後影響轉錄相關蛋白p70-S6k和4EBP1
之前的研究表明，蛋白合成對記憶的鞏固是至關重要的。因為 mTOR信號通道對蛋白的翻譯和合成非常重要，課題組探索是否 miR-181a能夠調節蛋白翻譯來參與在CFC訓練後鞏固記憶。
第一：課題組選擇了mTOR下游的目標蛋白p70-S6k 和4EBP1，來探索是否增加mTOR的活性能夠調節蛋白翻譯。結果發現： HC+anta組與HC + veh組相比p70-S6k 和4EBP1蛋白活性顯著下降，揭示出阻斷miR-181a能夠下調p70-S6k 和4EBP1蛋白水準變化。
第二：小鼠在經過CFC訓練以後CFC + veh組比HC + veh組的 p70-S6k 和4EBP1蛋白活性較高；然而，注射antagomir後， CFC + anta組的 p70-S6k 和4EBP1蛋白活性在cfc訓練4h以後下降。
綜上所述，CFC訓練以後miR-181a能夠促進p70-S6k 和4EBP1蛋白活性，從而增加mTOR 信號通道蛋白翻譯。
6
miR-181a 調控的恐懼記憶鞏固依賴於PRKAA1 和REDD1
為了這個目的，首先檢測是否 PRKAA1 和REDD1蛋白是海馬依賴性記憶的功能蛋白。所以使用了PRKAA1蛋白的啟動劑 AICAR和抑制劑 Compound 9。構建了REDD1干擾的慢病毒質粒 siREDD1和過表達REDD1的質粒並且都帶有GFP螢光。
課題組實驗分為4組 GFP + veh, GFP + AICAR,REDD1-OE + veh, 和REDD1-OE + AICAR。注射REDD1-OE 和AICAR組的小鼠在經過CFC訓練後，與注射GFP + veh組小鼠經過CFC訓練1h後電休克凍結時間相同。表明PRKAA1和REDD1蛋白對恐懼記憶獲得和短期記憶訓練沒有相關性。
為此課題組延長了訓練時間到24h，結果發現注射REDD1-OE, AICAR, 和REDD1-OE + AICAR組與載體組相比有較低的凍結時間。表明PRKAA1和REDD1蛋白水準的升高能夠損害了恐懼記憶的鞏固。同樣的注射 siREDD1 和 C9後，有同樣的效果。
但是，進行長期記憶訓練24h後，注射siREDD1 和 C9以及 siREDD1 + C9，電休克（0.4MA）後顯著提升了凍結時間。表明阻止了PRKAA1和REDD1蛋白的表達增強恐懼記憶的鞏固。
為了最終的目的，課題組繼續探討 miR-181a過表達後能夠增加恐懼記憶的整合。
注射REDD1-OE + AICA組與 GFP + veh組相比凍結時間較低，表明PRKAA1和REDD1蛋白功能的增加抑制了恐懼記憶的整合；
181a-OE + REDD1-OE + AICAR組與 REDD1-OE + AICAR組相比凍結時間沒有變化，6F表明增加PRKAA1和REDD1蛋白功能能夠阻斷 miR-181a-OE誘導的恐懼記憶整合。
綜上所述， miR-181a對於海馬恐懼記憶的整合依賴於PRKAA1和REDD1蛋白。
7
miR-181a對於海馬恐懼記憶的整合依賴於mTOR信號通道
課題組分了四組Scr + veh, siREDD1 + C9, Scr+rapamycin和siREDD1 + C9+rapamycin檢測電休克後的凍結時間，結果發現：
siREDD1 + C9組比 Scr + veh組有較高的凍結時間，表明去掉PRKAA1和REDD1功能蛋白的影響能夠增強恐懼記憶的整合；
Scr+rapamycin組比 Scr + veh組有較低的凍結時間；
siREDD1 + C9+rapamycin組比siREDD1 + C9組凍結時間低。7B,這些結果表明，抑制mTOR活性能夠減少PRKAA1和REDD1功能蛋白損傷增強的記憶整合；
綜上所述，PRKAA1和REDD1 蛋白通過抑制mTOR活性參與入恐懼記憶的整合。
181a-OE+rapamycin 組呈現出顯著的凍結時間下降（與載體對照組相比），但是與 GFP+rapamycin組的相同。表明抑制mTOR的活性能夠去除miR-181a 增高誘導的恐懼記憶整合程度增強。
綜上所述，miR-181a對於海馬恐懼記憶的整合依賴於mTOR信號通道。
以上，便是miR-181a與mTOR信號通道擦出的火花，書寫了兩條重要的線路，有沒有讓你學習的地方呢？
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綜上所述，miR-181a能夠減少PRKAA1和REDD1的蛋白水準和增加 mTOR活性水準的變化。
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miR-181a 能夠在經過CFC訓練後影響轉錄相關蛋白p70-S6k和4EBP1
之前的研究表明，蛋白合成對記憶的鞏固是至關重要的。因為 mTOR信號通道對蛋白的翻譯和合成非常重要，課題組探索是否 miR-181a能夠調節蛋白翻譯來參與在CFC訓練後鞏固記憶。
第一：課題組選擇了mTOR下游的目標蛋白p70-S6k 和4EBP1，來探索是否增加mTOR的活性能夠調節蛋白翻譯。結果發現： HC+anta組與HC + veh組相比p70-S6k 和4EBP1蛋白活性顯著下降，揭示出阻斷miR-181a能夠下調p70-S6k 和4EBP1蛋白水準變化。
第二：小鼠在經過CFC訓練以後CFC + veh組比HC + veh組的 p70-S6k 和4EBP1蛋白活性較高；然而，注射antagomir後， CFC + anta組的 p70-S6k 和4EBP1蛋白活性在cfc訓練4h以後下降。
綜上所述，CFC訓練以後miR-181a能夠促進p70-S6k 和4EBP1蛋白活性，從而增加mTOR 信號通道蛋白翻譯。
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miR-181a 調控的恐懼記憶鞏固依賴於PRKAA1 和REDD1
為了這個目的，首先檢測是否 PRKAA1 和REDD1蛋白是海馬依賴性記憶的功能蛋白。所以使用了PRKAA1蛋白的啟動劑 AICAR和抑制劑 Compound 9。構建了REDD1干擾的慢病毒質粒 siREDD1和過表達REDD1的質粒並且都帶有GFP螢光。
課題組實驗分為4組 GFP + veh, GFP + AICAR,REDD1-OE + veh, 和REDD1-OE + AICAR。注射REDD1-OE 和AICAR組的小鼠在經過CFC訓練後，與注射GFP + veh組小鼠經過CFC訓練1h後電休克凍結時間相同。表明PRKAA1和REDD1蛋白對恐懼記憶獲得和短期記憶訓練沒有相關性。
為此課題組延長了訓練時間到24h，結果發現注射REDD1-OE, AICAR, 和REDD1-OE + AICAR組與載體組相比有較低的凍結時間。表明PRKAA1和REDD1蛋白水準的升高能夠損害了恐懼記憶的鞏固。同樣的注射 siREDD1 和 C9後，有同樣的效果。
但是，進行長期記憶訓練24h後，注射siREDD1 和 C9以及 siREDD1 + C9，電休克（0.4MA）後顯著提升了凍結時間。表明阻止了PRKAA1和REDD1蛋白的表達增強恐懼記憶的鞏固。
為了最終的目的，課題組繼續探討 miR-181a過表達後能夠增加恐懼記憶的整合。
注射REDD1-OE + AICA組與 GFP + veh組相比凍結時間較低，表明PRKAA1和REDD1蛋白功能的增加抑制了恐懼記憶的整合；
181a-OE + REDD1-OE + AICAR組與 REDD1-OE + AICAR組相比凍結時間沒有變化，6F表明增加PRKAA1和REDD1蛋白功能能夠阻斷 miR-181a-OE誘導的恐懼記憶整合。
綜上所述， miR-181a對於海馬恐懼記憶的整合依賴於PRKAA1和REDD1蛋白。
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miR-181a對於海馬恐懼記憶的整合依賴於mTOR信號通道
課題組分了四組Scr + veh, siREDD1 + C9, Scr+rapamycin和siREDD1 + C9+rapamycin檢測電休克後的凍結時間，結果發現：
siREDD1 + C9組比 Scr + veh組有較高的凍結時間，表明去掉PRKAA1和REDD1功能蛋白的影響能夠增強恐懼記憶的整合；
Scr+rapamycin組比 Scr + veh組有較低的凍結時間；
siREDD1 + C9+rapamycin組比siREDD1 + C9組凍結時間低。7B,這些結果表明，抑制mTOR活性能夠減少PRKAA1和REDD1功能蛋白損傷增強的記憶整合；
綜上所述，PRKAA1和REDD1 蛋白通過抑制mTOR活性參與入恐懼記憶的整合。
181a-OE+rapamycin 組呈現出顯著的凍結時間下降（與載體對照組相比），但是與 GFP+rapamycin組的相同。表明抑制mTOR的活性能夠去除miR-181a 增高誘導的恐懼記憶整合程度增強。
綜上所述，miR-181a對於海馬恐懼記憶的整合依賴於mTOR信號通道。
以上，便是miR-181a與mTOR信號通道擦出的火花，書寫了兩條重要的線路，有沒有讓你學習的地方呢？
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