作者: 七七
在過去幾年中， 生物製藥行業已轉向由哺乳動物細胞表達系統進行生物製劑的生產。 目前為止所有哺乳動物細胞表達系統中，
宿主細胞
圖片來源於參考文獻
①中國倉鼠卵巢細胞(CHO)
CHO細胞廣泛用於糖蛋白的生產，
雖然CHO細胞在糖蛋白生產中具有許多優點， 但對於某些類型的人類蛋白糖基化其還不能催化表達，
②人類細胞系
有一種生產人源化糖蛋白的方法就是採用人類細胞系進行蛋白生產， 可以擔保的是， 即使不是理想的糖蛋白類型， 至少不會引起免疫反應。 現階段應用最多的分別是來自人胚胎腎臟和纖維肉瘤的HEK293和HT-1080細胞， Xigris就是由HEK293生產的， 同時也是第一個由人類細胞系合成的被FDA和EMA批准的蛋白。 在HT-1080細胞中也有四種蛋白(Agalsidase alfa, Epoetin delta, Idursulfase和Velaglucerase alfa)的生產獲得FDA或EMA批准，
現階段一些人類細胞系還用於臨床前研究和/或重組糖蛋白生產的臨床開發階段， 如PER.C6細胞， 這些細胞即使不用擴增相關基因也可得到高產量蛋白。 MOR103和CL184都是由PER.C6生產的治療蛋白， 目前均已開展臨床1/2研究。 由HEK293S細胞和人類B細胞融合得到的HKB-11細胞， 展現了高濃度的蛋白生產及α2,3和α2,6-唾液酸連接。
③其他哺乳動物細胞系
幼年倉鼠腎細胞(BHK)常用於疫苗的生產， 目前只有兩種重組糖蛋白是用BHK細胞生產的， 凝血因數VIIa和VIII。 這些大分子蛋白由於其大量的糖基化和硫酸化水準， 對於BHK細胞來說是很有挑戰的。
鼠科骨髓瘤細胞(NS0和Sp2/0)， 來源於不再合成本源免疫球蛋白的腫瘤細胞， 也可用於生產商業用單抗如西妥昔單抗(Cetuximab)和帕利珠單抗(Palivizumab)。 2015年， FDA批准了三種由鼠細胞生產的單抗Dinutuximab、Necitumumab和Elotuzumab， 分別用於治療不同的癌症。 另外， 鼠細胞表達的Neu5Gc和α-gal糖基化水準比蒼鼠細胞要高， 因此會增加免疫原性的風險。
④非哺乳細胞細胞系和其他表達系統
雖然採用哺乳系統生產重組蛋白是近十年間的趨勢，但是還有其他表達體系也可用於重組蛋白生產。由於這些生物細胞缺少所需的相關酶機制，不適合生產含有糖鏈的蛋白，因此其常用於不含糖基化的蛋白生產。細菌表達體系具有快速增殖、高表達蛋白的優勢，然而蛋白往往會形成聚體，並且由於分子伴侶蛋白的缺失必須通過萃取才能獲得。一些商業化的蛋白如天冬醯胺酶、膠原酶，其本身不含糖鏈，常用細菌表達體系生產。酵母表達體系具有細菌同樣的優勢，增殖速度快、蛋白表達高，但這些蛋白往往具有高甘露糖糖型，對人體可能具有免疫原性且療效不高，例如奧克纖溶酶。
對於植物和昆蟲細胞，兩者都可以生產含有複雜糖基化的蛋白，但其類型結構與人類相差較大。事實上，植物表達以α1,3-果糖和β1,2-木糖為核心的糖鏈，完全與人類的不同，且可能會有免疫原性。昆蟲細胞生產的N-糖型不是高甘露糖型就是寡甘糖糖型，植物和昆蟲細胞的糖基化水準中都缺少唾液酸化。在植物和昆蟲細胞中也有採用糖基化基因工程對其進行改造而生產蛋白的。2012年，FDA批准首個由植物細胞生產的治療性重組蛋白taliglucerase alfa。在昆蟲體系中批准通過的治療性蛋白有人類乳頭瘤病毒疫苗、前列腺癌疫苗和流感疫苗。最近，一些治療性蛋白在轉基因動物中也得到了。和其他哺乳動物表達系統一樣，轉基因動物表達蛋白的糖基化結構與人類也有些不同。市場中首個轉基因動物生產的治療蛋白是抗血栓藥物重組人抗凝血酶Ⅲ，是從轉基因羊奶中獲得的。之後又有兩種蛋白獲批，分別是從轉基因兔奶中得到的重組C1-Esterase抑制劑和轉基因雞蛋中得到的重組人源化溶酶體酸性脂肪酶。
細胞工程
在製藥企業中，糖蛋白的生產在細胞的瞬轉或穩轉基因表達體系中都得到實現。當要求快速和經濟時，瞬轉表達依然是蛋白生產的首選，其跳過了冗長的篩選步驟，只需將含有目標基因的質粒導入細胞中便可，速度更快，更具效率。蛋白合成速率依賴於許多因素，如轉染時的有效率、轉染試劑的細胞毒性以及培養時的補料策略等，因此瞬轉雖然沒有穩轉的蛋白表達水準高，但對於多數情況下瞬轉更為有效。事實上，由於瞬轉時的質粒是處於染色體外面的，細胞分裂時容易造成質粒丟失，進而限制了蛋白的產量。目前為止，通過病毒質粒進行的基因治療主要還是由瞬轉完成。當進行大規模的糖蛋白生產時，穩定的基因表達系統是更好的選擇。為提高蛋白產量、工藝耐受性及減少細胞培養時間，在這些體系中已經做了多方面的努力及優化。
圖片來源於參考文獻
①篩選系統
為提高蛋白合成速率及篩選效率，近年來發展了很多篩選系統。在穩定表達體系中，將目標cDNA整合在質粒時往往會再加入一段基因標記物，使其在篩選過程中帶有一定的優勢。質粒的拷貝數和整合到宿主基因中的位點是穩定基因表達系統中的關鍵因素。在生物製藥中有兩種常見的篩選標誌，穀氨醯胺合成酶基因(glutamine synthetase，GS)和二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolatereductase，DHFR)。GS篩選系統最初是由Celltech (Lonza)開發的，通過由重組GS基因構建的穀氨醯胺營養缺陷互補株得到。由於NS0和Sp2/0只表達少量的內源性GS，因此只需將穀氨醯胺從培養基中移除便可滿足篩選條件。而在CHO細胞系中，為增加GS篩選體系的篩選壓力還需向培養基中添加蛋氨酸亞碸胺(methionine sulfoximine，MSX，谷氨酸類似物)，MSX可以抑制內源性穀氨醯胺活性。為增加此篩選系統的性能，Eli Lilly已經在CHO細胞系中開發出了穀氨醯胺合成酶基因敲除細胞系(KO)。同樣，為建立DHFR篩選系統在CHO細胞中也構建了DHFR缺陷株。將重組DHFR基因整合到質粒中，將所構建的細胞株在不含核苷酸且DHFR酶活抑制劑(氨甲蝶呤)存在的培養基中進行培養，隨著氨甲蝶呤的濃度培養，目標基因的拷貝數也在不斷增加。除去上面提到的兩個篩選系統，還有其他篩選系統如OSCAR，但目前為止只有DHFR和GS篩選系統被用於大規模生產中。
②基因表達
上面提到的篩選系統都可以達到我們的目的，但是其包含目標基因的質粒是隨機的整合在宿主基因中的，這種隨機的整合不僅會引起細胞群的不一致性，而且不同細胞株的蛋白表達量也會有很大區別。這種轉基因很可能導入到異染色質區域，從而導致基因表達水準很低，而要從大量的細胞池中篩選出將質粒整合到核染色質區域的稀有細胞株將是一項繁冗的工作，因此合適的基因編輯工具將會大大增加效率。目前，已有多種分子和細胞生物工具針對特定的基因位點進行整合，這將幫助生物製藥公司減少基因整合的隨機性及對高表達細胞株的預測。雖然與隨機整合策略相比，分離出高產穩定的細胞系需要更多的工作，但這依然是一個更具吸引的方法，因為其可以控制和預測子代克隆的表達水準。當目標基因與篩選標記物在同一質粒上整合到核染色質區域時，目標基因及標記物的表達增加的幾率都會增加。
第一代基因工具，使用特異性重組酶靶向特定DNA位點進行敲除，有整合酶Cre/Lox和Flp/FRT。重組酶介導的盒式交換技術(RMCE)由於其可以這點靶向基因嵌入物而備受企業喜歡，RMCE利用重組酶對DNA不同識別位點突變體的識別差異，通過兩次相對獨立的重組反應產生一種交換的效果。RMCE技術提高了工業化穩定表達單抗的CHO細胞的構建成功率，縮短了細胞株構建時間。
第二代基因工具中，則採用的不同種類的內切酶，如鋅指核糖核酸酶(ZFN)、轉錄啟動因數樣效應物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9。這些內切酶可以誘導宿主DNA特定位點的雙鏈斷開，從而促進質粒通過非同源末端連接進行整合或同源的直接修復。ZFN和TALEN技術都能在核酸酶效應區域添加特定的DNA序列，因此其可以開發出一種具有高特異性及同源性的DNA重組序列。由於基因序列中包含眾多的重複序列及高度同源DNA序列，為增加內切酶的特異性及減少脫靶效應，一種基於蛋白的基因編輯技術得以應用，CRISPR/Cas9。其是由Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA組成的，並且是RNA引導的基因編輯，這項技術目前已在CHO細胞應用於減少不同克隆間的蛋白產量差異性。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術可用于指定基因的敲除，如GS和DHFR基因，ZFN便是其中應用最成功的技術之一。雖然這些技術在指定基因敲除中優勢明顯，但還是會有挑戰，其一對宿主基因中的穩定及高表達熱點的確認。還應注意的是，單次的基因敲除並不能解決所有的問題，對於某些蛋白還可能需要進行其他的品質調整，如折疊程度、糖基化，這些也可以基因編輯實現。
還有一些運用較少的基因工具，如哺乳動物人造染色體表達技術(ACE)。這種微型基因組在細胞內可以自我控制的進行表達，其基因序列可根據需要進行定制並表達，並且應用於CHO中也得到了可觀的蛋白表達。在CHO細胞的補料分批培養中對ACE和隨機質粒整合系統進行比較，發現細胞表現及穩定性都具有可比性。此外，轉座子酶系統也可輕易的將目標基因導入到宿主基因中，如從鱗翅目昆蟲中純化得到的轉座子酶PiggyBac，其已在CHO細胞中得到了提高產量的證據。
某些順式作用表觀遺傳調控元件也可以用於提高細胞的產蛋白能力及穩定性，這些元件通過重塑核染色質環境可穩定目標基因轉錄活性。其中應用最多的一個順式作用元件為MAR，為真核基因特有的順式作用組件，由非組蛋白的纖維蛋白和大分子量的RNA組成三維網架體系。有研究表明，重組蛋白表達體系中存在MAR元件時可以明顯提高表達水準，但也有學者指出MAR對序列具有要求，只有在特定序列中才會表現出作用。其他遺傳調控組件還有UCOEs和STAR，已有研究運用UCOEs降低不同克隆間的表達差異性，關於STAR的應用還沒有報導過。
雖然採用哺乳系統生產重組蛋白是近十年間的趨勢，但是還有其他表達體系也可用於重組蛋白生產。由於這些生物細胞缺少所需的相關酶機制，不適合生產含有糖鏈的蛋白，因此其常用於不含糖基化的蛋白生產。細菌表達體系具有快速增殖、高表達蛋白的優勢，然而蛋白往往會形成聚體，並且由於分子伴侶蛋白的缺失必須通過萃取才能獲得。一些商業化的蛋白如天冬醯胺酶、膠原酶，其本身不含糖鏈，常用細菌表達體系生產。酵母表達體系具有細菌同樣的優勢，增殖速度快、蛋白表達高，但這些蛋白往往具有高甘露糖糖型，對人體可能具有免疫原性且療效不高，例如奧克纖溶酶。
對於植物和昆蟲細胞，兩者都可以生產含有複雜糖基化的蛋白，但其類型結構與人類相差較大。事實上，植物表達以α1,3-果糖和β1,2-木糖為核心的糖鏈，完全與人類的不同，且可能會有免疫原性。昆蟲細胞生產的N-糖型不是高甘露糖型就是寡甘糖糖型，植物和昆蟲細胞的糖基化水準中都缺少唾液酸化。在植物和昆蟲細胞中也有採用糖基化基因工程對其進行改造而生產蛋白的。2012年，FDA批准首個由植物細胞生產的治療性重組蛋白taliglucerase alfa。在昆蟲體系中批准通過的治療性蛋白有人類乳頭瘤病毒疫苗、前列腺癌疫苗和流感疫苗。最近，一些治療性蛋白在轉基因動物中也得到了。和其他哺乳動物表達系統一樣，轉基因動物表達蛋白的糖基化結構與人類也有些不同。市場中首個轉基因動物生產的治療蛋白是抗血栓藥物重組人抗凝血酶Ⅲ，是從轉基因羊奶中獲得的。之後又有兩種蛋白獲批，分別是從轉基因兔奶中得到的重組C1-Esterase抑制劑和轉基因雞蛋中得到的重組人源化溶酶體酸性脂肪酶。
細胞工程
在製藥企業中，糖蛋白的生產在細胞的瞬轉或穩轉基因表達體系中都得到實現。當要求快速和經濟時，瞬轉表達依然是蛋白生產的首選，其跳過了冗長的篩選步驟，只需將含有目標基因的質粒導入細胞中便可，速度更快，更具效率。蛋白合成速率依賴於許多因素，如轉染時的有效率、轉染試劑的細胞毒性以及培養時的補料策略等，因此瞬轉雖然沒有穩轉的蛋白表達水準高，但對於多數情況下瞬轉更為有效。事實上，由於瞬轉時的質粒是處於染色體外面的，細胞分裂時容易造成質粒丟失，進而限制了蛋白的產量。目前為止，通過病毒質粒進行的基因治療主要還是由瞬轉完成。當進行大規模的糖蛋白生產時，穩定的基因表達系統是更好的選擇。為提高蛋白產量、工藝耐受性及減少細胞培養時間，在這些體系中已經做了多方面的努力及優化。
圖片來源於參考文獻
①篩選系統
為提高蛋白合成速率及篩選效率，近年來發展了很多篩選系統。在穩定表達體系中，將目標cDNA整合在質粒時往往會再加入一段基因標記物，使其在篩選過程中帶有一定的優勢。質粒的拷貝數和整合到宿主基因中的位點是穩定基因表達系統中的關鍵因素。在生物製藥中有兩種常見的篩選標誌，穀氨醯胺合成酶基因(glutamine synthetase，GS)和二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolatereductase，DHFR)。GS篩選系統最初是由Celltech (Lonza)開發的，通過由重組GS基因構建的穀氨醯胺營養缺陷互補株得到。由於NS0和Sp2/0只表達少量的內源性GS，因此只需將穀氨醯胺從培養基中移除便可滿足篩選條件。而在CHO細胞系中，為增加GS篩選體系的篩選壓力還需向培養基中添加蛋氨酸亞碸胺(methionine sulfoximine，MSX，谷氨酸類似物)，MSX可以抑制內源性穀氨醯胺活性。為增加此篩選系統的性能，Eli Lilly已經在CHO細胞系中開發出了穀氨醯胺合成酶基因敲除細胞系(KO)。同樣，為建立DHFR篩選系統在CHO細胞中也構建了DHFR缺陷株。將重組DHFR基因整合到質粒中，將所構建的細胞株在不含核苷酸且DHFR酶活抑制劑(氨甲蝶呤)存在的培養基中進行培養，隨著氨甲蝶呤的濃度培養，目標基因的拷貝數也在不斷增加。除去上面提到的兩個篩選系統，還有其他篩選系統如OSCAR，但目前為止只有DHFR和GS篩選系統被用於大規模生產中。
②基因表達
上面提到的篩選系統都可以達到我們的目的，但是其包含目標基因的質粒是隨機的整合在宿主基因中的，這種隨機的整合不僅會引起細胞群的不一致性，而且不同細胞株的蛋白表達量也會有很大區別。這種轉基因很可能導入到異染色質區域，從而導致基因表達水準很低，而要從大量的細胞池中篩選出將質粒整合到核染色質區域的稀有細胞株將是一項繁冗的工作，因此合適的基因編輯工具將會大大增加效率。目前，已有多種分子和細胞生物工具針對特定的基因位點進行整合，這將幫助生物製藥公司減少基因整合的隨機性及對高表達細胞株的預測。雖然與隨機整合策略相比，分離出高產穩定的細胞系需要更多的工作，但這依然是一個更具吸引的方法，因為其可以控制和預測子代克隆的表達水準。當目標基因與篩選標記物在同一質粒上整合到核染色質區域時，目標基因及標記物的表達增加的幾率都會增加。
第一代基因工具，使用特異性重組酶靶向特定DNA位點進行敲除，有整合酶Cre/Lox和Flp/FRT。重組酶介導的盒式交換技術(RMCE)由於其可以這點靶向基因嵌入物而備受企業喜歡，RMCE利用重組酶對DNA不同識別位點突變體的識別差異，通過兩次相對獨立的重組反應產生一種交換的效果。RMCE技術提高了工業化穩定表達單抗的CHO細胞的構建成功率，縮短了細胞株構建時間。
第二代基因工具中，則採用的不同種類的內切酶，如鋅指核糖核酸酶(ZFN)、轉錄啟動因數樣效應物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9。這些內切酶可以誘導宿主DNA特定位點的雙鏈斷開，從而促進質粒通過非同源末端連接進行整合或同源的直接修復。ZFN和TALEN技術都能在核酸酶效應區域添加特定的DNA序列，因此其可以開發出一種具有高特異性及同源性的DNA重組序列。由於基因序列中包含眾多的重複序列及高度同源DNA序列，為增加內切酶的特異性及減少脫靶效應，一種基於蛋白的基因編輯技術得以應用，CRISPR/Cas9。其是由Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA組成的，並且是RNA引導的基因編輯，這項技術目前已在CHO細胞應用於減少不同克隆間的蛋白產量差異性。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術可用于指定基因的敲除，如GS和DHFR基因，ZFN便是其中應用最成功的技術之一。雖然這些技術在指定基因敲除中優勢明顯，但還是會有挑戰，其一對宿主基因中的穩定及高表達熱點的確認。還應注意的是，單次的基因敲除並不能解決所有的問題，對於某些蛋白還可能需要進行其他的品質調整，如折疊程度、糖基化，這些也可以基因編輯實現。
還有一些運用較少的基因工具，如哺乳動物人造染色體表達技術(ACE)。這種微型基因組在細胞內可以自我控制的進行表達，其基因序列可根據需要進行定制並表達，並且應用於CHO中也得到了可觀的蛋白表達。在CHO細胞的補料分批培養中對ACE和隨機質粒整合系統進行比較，發現細胞表現及穩定性都具有可比性。此外，轉座子酶系統也可輕易的將目標基因導入到宿主基因中，如從鱗翅目昆蟲中純化得到的轉座子酶PiggyBac，其已在CHO細胞中得到了提高產量的證據。
某些順式作用表觀遺傳調控元件也可以用於提高細胞的產蛋白能力及穩定性，這些元件通過重塑核染色質環境可穩定目標基因轉錄活性。其中應用最多的一個順式作用元件為MAR，為真核基因特有的順式作用組件，由非組蛋白的纖維蛋白和大分子量的RNA組成三維網架體系。有研究表明，重組蛋白表達體系中存在MAR元件時可以明顯提高表達水準，但也有學者指出MAR對序列具有要求，只有在特定序列中才會表現出作用。其他遺傳調控組件還有UCOEs和STAR，已有研究運用UCOEs降低不同克隆間的表達差異性，關於STAR的應用還沒有報導過。