作者: 知行
CHO細胞是目前用於單抗的生產最廣泛的細胞株， 用以培養CHO細胞的培養基含有豐富的營養物質， 如葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素等，
LDH
乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶， 存在於機體所有組織細胞的胞質內， 是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。 通過下調LDH-A的含量可以有效降低細胞培養過程中乳酸的積累， 這點在眾多的文獻中均已得到證實。 SooMin Noh等在GS篩選體系中運用shRNA技術構建了低表達LDH的細胞株CHO-K1 LDHsi、GSKO LDHsi，
在此研究中對其他代謝參數的改變也進行了探討， 如銨的積累， 基因改造細胞株也較對照組要低些， 這可能要歸功於GS篩選系統本身的優勢。 這種下調LDH表達量的技術不會影響到單抗的產量， Soo團隊在對單抗的品質屬性分析中發現LDH下調對糖基化具有影響， 但不會影響到聚體與電荷異質性。 但其並不推薦在GS系統中實行下調LDH的基因工程技術， 因其會影響到GS系統的篩選能力。 還有一點也是值得注意的， 完全的LDH基因去除對CHO細胞是致命的。
圖1 LDH下調細胞株CHO-K1 LDHsi(白色圓形)、GS KO LDHsi(白色方形)， 和其對照CHO-K1(黑色圓形)、GS KO(黑色方形)的乳酸累積比較 (來源於參考文獻1)
PYC2
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase， PYC2)重組表達是哺乳動物細胞中常見的降低乳酸形成的策略， PYC2是糖異生迴圈中重要的限速酶， 參與將乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油轉化生成葡萄糖的催化， 因此PYC2在CHO細胞中的高表達可以加速對乳酸的消耗。
Toussaint等在CHO細胞中成功構建了高表達PYC2的克隆，
Toussaint團隊還在批培養和補料分批培養中對PYC2-positive克隆(11號克隆)對乳酸降解的情況進行了驗證， 結果如圖2所示。 11號克隆的peak VCD幾乎超過對照組的兩倍， 後期乳酸也被消耗。 值得關注的是當使用11號克隆進行Fed-batch實驗時， 乳酸開始消耗時葡萄糖的含量還維持在40mM， 即PYC2-positive克隆對乳酸的降解不受葡萄糖濃度的限制。
圖2 PYC2-positive克隆與對照克隆的細胞密度(左)與乳酸積累(右)的比較 (圖片來源於參考文獻2)
銅離子
培養基成分始終是細胞培養中重要的一環， 其中微量元素銅離子曾在多種CHO細胞中被證實可以促進細胞生長及減少乳酸積累。 Sen Xu等在ambr 15微反應器中進行了相關實驗， 其在基礎培養基中添加了不同濃度的硫酸銅(1×➝200×)， 並在D4和D6分別進行了補糖操作。 結果見圖3， 通過比較D4和D6補糖後硫酸銅實驗組和對照組間細胞密度與乳酸含量的變化， 可知銅離子的添加可促進細胞對乳酸的消耗及細胞生長。
究其生化層面的原因， 銅離子是細胞色素c重要的輔因數， 而細胞色素c參與線粒體膜上電子的傳遞過程， 細胞色素c的多寡與銅離子直接相關。 研究表明， 線粒體氧化能力降低會造成高濃度的乳酸積累，而銅離子缺失會影響線粒體功能及代謝能力進而擴大乳酸生成路徑。銅離子的加入可能擴大了線粒體的氧化容量，從而降低了乳酸的累積。另外，銅離子添加會影響到單抗的品質，如增加鹼性峰的比例、降低高甘露糖型水準等。
圖3 不同濃度的銅離子對VCD及乳酸的影響(圖片來源於參考文獻3)
葡萄糖
用其他代謝緩慢的糖類代替葡萄糖的策略也是降解乳酸的途徑之一，其中半乳糖是研究較多的一種。用半乳糖、岩藻糖、甘露糖和麥芽糖作為第二碳源對乳酸積累的影響見圖4，除甘露糖外其他糖類的添加均可降低乳酸的積累；當以半乳糖代替葡萄糖時細胞活率出現快速下降，這是因為細胞對半乳糖的降解速率緩慢，為避免這種情況可考慮將其他糖類與半乳糖共同使用。
圖4 其他碳源對細胞活率和乳酸積累的影響 (圖片來源於參考文獻3)
低糖消耗乳酸也是細胞培養時常見的策略。早期的一項研究表明，高濃度的葡萄糖會導致高濃度的乳酸積累，限制葡萄糖及穀氨醯胺濃度後乳酸的含量也得到限制，但對於兩者的最低濃度範圍還沒有定論。Yogender等研究了30mM和10mM的葡萄糖對細胞生長和乳酸代謝的影響，其結果如圖5，雖然低濃度葡萄糖的細胞密度較高濃度葡萄糖低，但其乳酸含量也低些，證明低糖確實有利於乳酸降解。
同時，研究員還通過RNA-Seq技術對CHO細胞中的27629個基因進行了分析，其中10090個基因在兩種不同濃度葡萄培養時表達，而只有575個基因表達量具有區別。更精確的分析表明，涉及糖酵解、TCA迴圈和糖基化的基因在兩種不同濃度葡萄糖時均沒有超過2倍的表達量區別，也就是說控制低濃度的葡萄糖對單抗的糖基化影響不大。但有研究指出低濃度的葡萄糖會影響糖基化的位點，這可能也與細胞株有很大聯繫。
圖5 高濃度和低濃度情況下細胞生長、葡萄糖和乳酸代謝變化 (圖片來源於參考文獻4)
線粒體氧化能力降低會造成高濃度的乳酸積累，而銅離子缺失會影響線粒體功能及代謝能力進而擴大乳酸生成路徑。銅離子的加入可能擴大了線粒體的氧化容量，從而降低了乳酸的累積。另外，銅離子添加會影響到單抗的品質，如增加鹼性峰的比例、降低高甘露糖型水準等。
圖3 不同濃度的銅離子對VCD及乳酸的影響(圖片來源於參考文獻3)
葡萄糖
用其他代謝緩慢的糖類代替葡萄糖的策略也是降解乳酸的途徑之一，其中半乳糖是研究較多的一種。用半乳糖、岩藻糖、甘露糖和麥芽糖作為第二碳源對乳酸積累的影響見圖4，除甘露糖外其他糖類的添加均可降低乳酸的積累；當以半乳糖代替葡萄糖時細胞活率出現快速下降，這是因為細胞對半乳糖的降解速率緩慢，為避免這種情況可考慮將其他糖類與半乳糖共同使用。
圖4 其他碳源對細胞活率和乳酸積累的影響 (圖片來源於參考文獻3)
低糖消耗乳酸也是細胞培養時常見的策略。早期的一項研究表明，高濃度的葡萄糖會導致高濃度的乳酸積累，限制葡萄糖及穀氨醯胺濃度後乳酸的含量也得到限制，但對於兩者的最低濃度範圍還沒有定論。Yogender等研究了30mM和10mM的葡萄糖對細胞生長和乳酸代謝的影響，其結果如圖5，雖然低濃度葡萄糖的細胞密度較高濃度葡萄糖低，但其乳酸含量也低些，證明低糖確實有利於乳酸降解。
同時，研究員還通過RNA-Seq技術對CHO細胞中的27629個基因進行了分析，其中10090個基因在兩種不同濃度葡萄培養時表達，而只有575個基因表達量具有區別。更精確的分析表明，涉及糖酵解、TCA迴圈和糖基化的基因在兩種不同濃度葡萄糖時均沒有超過2倍的表達量區別，也就是說控制低濃度的葡萄糖對單抗的糖基化影響不大。但有研究指出低濃度的葡萄糖會影響糖基化的位點，這可能也與細胞株有很大聯繫。
圖5 高濃度和低濃度情況下細胞生長、葡萄糖和乳酸代謝變化 (圖片來源於參考文獻4)